LGALS1和LGALS3与JUNO、IZUMO1和CD9的相互作用
发布时间：2020-12-22 03:29
有性生殖是高等真核生物繁衍后代的基本途径,精子与卵子的融合包括配子结合与膜融合两个过程,是有性生殖的关键步骤。哺乳动物精卵融合是一个多分子参与的过程,但其详细的细胞分子机制仍不明确。精子上的IZUMO1和卵子上的JUNO及CD9是精卵膜融合过程中已知不可或缺的膜蛋白。其中IZUMO1与JUNO相互识别介导精卵粘附,然而分别表达IZUMO1和JUNO的体细胞能互相结合但不能融合。CD9的功能未知。因此,精卵融合过程应该还存在其他配子蛋白协助IZUMO1、JUNO和CD9。本实验通过酵母双杂交技术和间接免疫荧光技术研究了半乳糖苷凝集素家族的两个成员LGALS1和LGALS3与IZUMO1、JUNO和CD9的相互作用。首先,克隆了大鼠lgals1和lgals3的cDNA。构建了pGAD-lgals1和pGAD-lgals3的酵母表达载体,分别与实验室已有的pGBK-Juno、pGBK-Izumo1和pGBK-Cd9进行了酵母双杂交。结果发现LGALS1与JUNO存在相互作用,但与IZUMO1、CD9不存在相互作用;LGALS3与JUNO和IZUMO1均不存在相互作用。构建pGEX-lgals...
【文章来源】：内蒙古大学内蒙古自治区 211工程院校
【文章页数】：74 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
Galectin1-4的整体结构示意图
内蒙古大学硕士学位论文据 UniProt 数据库（UniProtKB-P09382 (LEG1_HUMAN)）注释：Galectin1 二级结构中形成 β 折叠，一处形成 α 螺旋（位于 102-104 个氨基酸残基处）。Galectin1 的三级结 1.2 B）[33]。每一个 mGal-1 的 N 端和 C 端都处于两个 mGal-1 结合面，而 Galectin1 的构 CRD 则位于远端[33]。1993 年发现人 Galectin1 的 His44、Asn46、Arg48、Glu71和 A保守的亲水性残基（图 1.2A 中加下划线氨基酸）[13]，后被证实是 CRD 的糖结合活性 的主要组成[41]；另外，一些非带电氨基酸残基，如：Glyl4、Phe45、Pro47、Phe49、Va8、Pro78和 Phe79等（图 1.2A 中加着重号的氨基酸）也很保守，这些氨基酸残基可能对蛋白质的结构框架也起到重要作用[13]。图 1.2 A 中加波浪线的氨基酸为通过范德华力化合物作用的残基[33]。p13A
Digestion product of pGAD-lgals1 (420 bp) by Nde IBamH I. B: Lane M: Marker (DL-5000)；Lane 1: Digeproduct of pGAD-lgals3 (1783 bp) by Nde I and BamH I..2 转化感受态酵母后的菌落 PCR 鉴定LiAc 法制备 Y2H、Y187 感受态酵母。分别将 pGAD-lgals1 转入感受态 Y187；pGBK-JunBK-Izumo1 转入感受态 Y2H。分别挑取 SD/-Leu 和 SD/-Trp 平板上长势良好的单菌落（）溶于 20 μL 0.9%的生理盐水中混匀，沸水煮 5 min，-20℃冰冻 30 min，重复 2 次。后取 1 μL 作为模板进行 PCR 鉴定，PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图 2.10。泳化 pGBK-Izumo1 质粒的酵母（Y2H）菌落 PCR 产物电泳结果，特异性条带位于 100，与Izumo1的预期产物（1089 bp）大小相符。泳道2为转化pGAD-lgals1质粒的酵母（Y1 PCR 产物电泳结果，特异性条带位于 500 bp 微下，与 lgals1 预期产物（420） bp 大。图中泳道 3 为转化 pGBK-Juno 质粒的酵母（Y2H）菌落 PCR 产物电泳结果，位于 500的中间有特异性条带，与预期 Juno PCR 产物（609 bp）大小相符。图 2.10 结果证明AD-lgals1、pGBK-Juno、pGBK-Izumo1 成功转入酵母感受态细胞，可用于下一步实验250100500bp M A1 A2 A3 B1 M bp bp M C1 C2 C3
本文编号：2931052
【文章来源】：内蒙古大学内蒙古自治区 211工程院校
【文章页数】：74 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
Galectin1-4的整体结构示意图
内蒙古大学硕士学位论文据 UniProt 数据库（UniProtKB-P09382 (LEG1_HUMAN)）注释：Galectin1 二级结构中形成 β 折叠，一处形成 α 螺旋（位于 102-104 个氨基酸残基处）。Galectin1 的三级结 1.2 B）[33]。每一个 mGal-1 的 N 端和 C 端都处于两个 mGal-1 结合面，而 Galectin1 的构 CRD 则位于远端[33]。1993 年发现人 Galectin1 的 His44、Asn46、Arg48、Glu71和 A保守的亲水性残基（图 1.2A 中加下划线氨基酸）[13]，后被证实是 CRD 的糖结合活性 的主要组成[41]；另外，一些非带电氨基酸残基，如：Glyl4、Phe45、Pro47、Phe49、Va8、Pro78和 Phe79等（图 1.2A 中加着重号的氨基酸）也很保守，这些氨基酸残基可能对蛋白质的结构框架也起到重要作用[13]。图 1.2 A 中加波浪线的氨基酸为通过范德华力化合物作用的残基[33]。p13A
Digestion product of pGAD-lgals1 (420 bp) by Nde IBamH I. B: Lane M: Marker (DL-5000)；Lane 1: Digeproduct of pGAD-lgals3 (1783 bp) by Nde I and BamH I..2 转化感受态酵母后的菌落 PCR 鉴定LiAc 法制备 Y2H、Y187 感受态酵母。分别将 pGAD-lgals1 转入感受态 Y187；pGBK-JunBK-Izumo1 转入感受态 Y2H。分别挑取 SD/-Leu 和 SD/-Trp 平板上长势良好的单菌落（）溶于 20 μL 0.9%的生理盐水中混匀，沸水煮 5 min，-20℃冰冻 30 min，重复 2 次。后取 1 μL 作为模板进行 PCR 鉴定，PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图 2.10。泳化 pGBK-Izumo1 质粒的酵母（Y2H）菌落 PCR 产物电泳结果，特异性条带位于 100，与Izumo1的预期产物（1089 bp）大小相符。泳道2为转化pGAD-lgals1质粒的酵母（Y1 PCR 产物电泳结果，特异性条带位于 500 bp 微下，与 lgals1 预期产物（420） bp 大。图中泳道 3 为转化 pGBK-Juno 质粒的酵母（Y2H）菌落 PCR 产物电泳结果，位于 500的中间有特异性条带，与预期 Juno PCR 产物（609 bp）大小相符。图 2.10 结果证明AD-lgals1、pGBK-Juno、pGBK-Izumo1 成功转入酵母感受态细胞，可用于下一步实验250100500bp M A1 A2 A3 B1 M bp bp M C1 C2 C3
本文编号：2931052
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