靶向修饰H19/IGF2的CTCF结合位点DNA甲基化对小鼠胚胎干细胞及早期胚胎发育的影响
发布时间：2020-12-31 03:01
基因组印记（Genomic Imprinting）是控制印记基因（imprinted genes）表达的表观遗传调节机制,通过选择性地沉默父本或母本来源的一个等位基因,参与调节哺乳动物生长和发育,并与家族遗传病有关。人的印记基因H19和Igf2连锁位于染色体11p15.5区,由一套增强子调节基因表达,受H19/Igf2基因间的差异甲基化区域DMR（Differentially Methylated Region）控制,DMR区域的甲基化影响CTCF（CCCTC-binding factor）的结合控制H19和Igf2差异性表达,但目前对CTCF结合区域DNA甲基化的调节还有待认识。本研究利用CRISPR/dCas9介导的DNMT3A或TET特异修饰CTCF结合位点DNA甲基化状态,研究其对印记基因的表达、胚胎干细胞的细胞全能性和早期胚胎发育的影响。本研究首先利用CRISPR/dCas9技术,针对H19/Igf2的CTCF的四个结合位点,设计了8种gRNA,构建pgRNA-humanized-Igf2载体,同时与CRISPR/dCas9-Dnmt3a和CRISPR/dCas9-Tet载体...
【文章来源】：内蒙古大学内蒙古自治区 211工程院校
【文章页数】：85 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
pgRNA-humanized载体酶切鉴定图
图 2.2 共转染效率的检测。A. 流式细胞仪检测转染效率； B. 转染细胞后荧光强度检测Fig. 2.2 Detection of co-transfection efficiency.A. the transfection efficiency of detected by cells flow cytometry; B. the fluorescence intensity after transfection.根据流式细胞仪以及显微镜的观测下得出，在共转染时，Fuw-dCas9-Dnmt3a-P2A-tagBFP与 pgRNA-humanized 各取 4μg 转染细胞时，细胞的转染效率最高。可以达到 11.9%(图 2.2A)。荧光显微镜下可以观察的出，细胞在共转之后，在质粒在转染 48h 后在细胞内可以稳定表达（图 2.2 B）。3.1.3 载体的作用效果及筛选对构建的 8 种 pgRNA-humanized-Igf2 分别与 Fuw-dCas9-Dnmt3a-P2A-tagBFP 载体和Fuw-dCas9-Tet-P2A-tagBFP 载体共转染细胞，经 qPCR 验证，筛选对其 Igf2 表达改变最大过表达载体及沉默载体。在转染 48h 时提取细胞 RNA，进行 qPCR 验证。
35图 2.5 CTCF 结合位点甲基化的检测。. 在 MEFs 细胞中转入 dCas9-Dnmt3a 和 dCas9-Tet 后，CTCF 结合位点的甲基化检测； B. 在 MES 转dCas9-Dnmt3a 后，CTCF 结合位点的甲基化检测。Fig. 2.5 Detection of methylation of four CTCF sites at H19/Igf2.A. Detection of methylation of CTCF binding sites after transfer of dCas9-Dnmt3a and dCas9-Tet into MEFs
【参考文献】：
期刊论文
[1]Manifestations of type 2 diabetes in corneal endothelial cell density,corneal thickness and intraocular pressure[J]. Stella Briggs,Uchechukwu L Osuagwu,Essam M AlHarthi. The Journal of Biomedical Research. 2016(01)
本文编号：2948825
【文章来源】：内蒙古大学内蒙古自治区 211工程院校
【文章页数】：85 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
pgRNA-humanized载体酶切鉴定图
图 2.2 共转染效率的检测。A. 流式细胞仪检测转染效率； B. 转染细胞后荧光强度检测Fig. 2.2 Detection of co-transfection efficiency.A. the transfection efficiency of detected by cells flow cytometry; B. the fluorescence intensity after transfection.根据流式细胞仪以及显微镜的观测下得出，在共转染时，Fuw-dCas9-Dnmt3a-P2A-tagBFP与 pgRNA-humanized 各取 4μg 转染细胞时，细胞的转染效率最高。可以达到 11.9%(图 2.2A)。荧光显微镜下可以观察的出，细胞在共转之后，在质粒在转染 48h 后在细胞内可以稳定表达（图 2.2 B）。3.1.3 载体的作用效果及筛选对构建的 8 种 pgRNA-humanized-Igf2 分别与 Fuw-dCas9-Dnmt3a-P2A-tagBFP 载体和Fuw-dCas9-Tet-P2A-tagBFP 载体共转染细胞，经 qPCR 验证，筛选对其 Igf2 表达改变最大过表达载体及沉默载体。在转染 48h 时提取细胞 RNA，进行 qPCR 验证。
35图 2.5 CTCF 结合位点甲基化的检测。. 在 MEFs 细胞中转入 dCas9-Dnmt3a 和 dCas9-Tet 后，CTCF 结合位点的甲基化检测； B. 在 MES 转dCas9-Dnmt3a 后，CTCF 结合位点的甲基化检测。Fig. 2.5 Detection of methylation of four CTCF sites at H19/Igf2.A. Detection of methylation of CTCF binding sites after transfer of dCas9-Dnmt3a and dCas9-Tet into MEFs
【参考文献】：
期刊论文
[1]Manifestations of type 2 diabetes in corneal endothelial cell density,corneal thickness and intraocular pressure[J]. Stella Briggs,Uchechukwu L Osuagwu,Essam M AlHarthi. The Journal of Biomedical Research. 2016(01)
本文编号：2948825
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/2948825.html
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