细胞自噬过程蛋白质乙酰化位点特异性的研究

发布时间：2020-12-31 02:11

　　目的:在细胞自噬发生过程时,蛋白质乙酰化修饰参与并调控相关自噬通路。但迄今为止,自噬与蛋白乙酰化组学的关系尚未阐明。为此,我们将探究雷帕霉素诱导细胞自噬发生的过程中,蛋白质乙酰化组学的特征及其乙酰化位点在自噬过程中的修饰特征。方法:首先主要采用SILAC标记技术、乙酰化赖氨酸抗体富集并行串联质谱技术,对细胞自噬过程中整体蛋白表达水平和乙酰化水平进行高通量检测,然后通过相关生物信息学技术对质谱检测结果进行蛋白质乙酰化组学总体特征的全面分析。之后再通过位点定点突变技术、基因转染技术验证乙酰化酶p300的乙酰化修饰位点对细胞自噬的影响。结果:（1）我们共检测到1081个蛋白、2135个乙酰化位点,其中421个位点在细胞自噬过程中存在明显的乙酰化水平的变化。80.8%的乙酰化位点显著下调,19.2%的乙酰化位点显著上调。（2）乙酰化位点相关基序（MOTIF）分析表明,存在5个与自噬相关的乙酰化基序,分别为[G-K-AcK],[A-X-AcK],[G-AcK],[K-AcK]和[AcK-K]。所有下调的位点的乙酰化相关基序富集为[G-AcK],这些位点点可能是受乙酰化酶p300调控的。（3）乙酰... 

【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

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【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图１．免疫印迹分析在加或不加ｌ〇〇ｎＭＢａｆ－Ａｌ的情况下用０．１?雷帕霉素处理不同时间??－

理１２?ｈ。细胞处理完成后，实验组与对照组中分别取等量的细胞混合并用胰蛋白??酶消化，乙酰化的肽段通过抗乙酰化赖氨酸的抗体亲和富集，之后串联质谱的结??果通过ＭａｘＱｕａｎｔ软件的Ａｎｄｒｏｍｅｄａ搜索引擎［１５］进行搜索（图２）。??０．１?ｐＭ??Ｃｏｎｔｒｏｌ?Ｒａｐａｍｙｃｉｎ??，３Ｃ＃?Ｌｙｓｉｎｅ?Ｌｙｓｉｎｅ??－Ｈｅａｖｙ＂?－Ｌｉｇｈｔ＂??Ｍｉｘ?１１：１??Ｐｒｏｔｅｉｎ?ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ??１??Ｔｒｙｐｓｉｎ?Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ??Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ?ｏｆ??ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ?ｐｅｐｔｉｄｅｓ?％??Ｉ?＼??ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ＭＳ／ＭＳ?ａｎａｌｙｓｉｓ??Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ?Ａｎａｌｙｓｉｓ??图２．雷帕霉素诱导的自噬定量乙酰化谱的实验策略??Ｆｉｇｕｒｅ?２．?Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ?ｓｔｒａｔｅｇｙ?ｆｏｒ?ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ?ａｃｅｔｙｌｏｍｅ?ｐｒｏｆｉｌｅ?ｕｐｏｎ??ｒａｐａｍｙｃｉｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ?ａｕｔｏｐｈａｇｙ．??同时，为了获得更为可靠的数据，我们进行了三次生物学重复。结果表明，??三次生物学重复Ｐｅａｒｓｏｎ相关系数处于０．８２？０．８３，表明该技术的重复性（图３）。??所有的蛋白、肽段以及修饰位点均经过ＦＤＲ校正（ＦＤＲ＜０．０１）。同时

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