4株乳杆菌胞壁蛋白酶的分离纯化及鉴定
发布时间：2020-12-31 07:56
乳酸杆菌的蛋白水解系统包括细胞胞壁蛋白酶（cell-envelope proteinase,CEP）,寡肽转运系统和内肽酶。其中,CEP作为该系统的关键酶发挥着重要作用,不仅参与酪蛋白降解,助发酵产品风味和质地的形成,还可酶解食物蛋白释放出生物活性肽,有益于消费者健康。目前关于乳杆菌CEP分离纯化的报道不多,对其结构鉴定更是鲜有报道,本课题采用不同提取方法研究4种乳杆菌CEP的提取效果;探讨双水相系统对CEP分离的影响,单因素及响应面法优化确定双水相分离CEP最佳条件;采用超滤、葡聚糖凝胶色谱对其分离纯化;电泳测酶分子量,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF-MS）鉴定CEP,比较不同乳杆菌的产酶差异。研究结论如下:1.选取的10种方法提取4株乳杆菌CEP存在显著差异。Ca2+-free法为植物乳杆菌LP69和鼠李糖乳杆菌LR22 CEPs的最适提取方法;保加利亚乳杆菌LB6和干酪乳杆菌L61 CEPs的最适提取剂分别是盐酸胍和十二烷基硫酸钠（SDS）。综合考虑提取方法对四株菌的通用性及效果,选用Ca2+-free法处理4种...
【文章来源】：陕西科技大学陕西省
【文章页数】：91 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
乳酸杆菌蛋白水解体系的简化结构示意图
图 3-1 酪氨酸及蛋白质标准曲线Fig. 3-1 The standard curve of tyrosine and bovine serum albumin酪蛋白标准曲线回归方程为 y=0.01x+0.0012，R2=0.9996；蛋白质标准曲线回归方程为 y=0.0076x+0.0085，R2=0.9991，表明酪蛋白标准曲线及蛋白质标准曲线中的浓度与吸光度间有良好的线性关系。3.2 探究提取方法对乳杆菌胞壁蛋白酶的影响3.2.1 不同提取剂最适浓度的确定将四种益生乳杆菌 LP69、LR22、LB6 和 L61 菌体分别悬浮于表 2-3 所述的条件下培养，在 4℃下 4500r/min 离心 20min 后取上清液即为 CEP 粗酶液。通过一系列浓度梯度试验，测定粗酶液的酶活、蛋白含量及比活力，最终确定十种提取剂提取四种乳杆菌CEP 的最适浓度，结果见表 3-1。表 3-1 使用不同提取剂提取四种乳杆菌 CEP 的最适浓度Tab. 3-1 The optimal concentration of CEP obtained from different extraction agents提取方法四种乳杆菌 CEP 的最适浓度
-4 分别为 Sephadex G-100 纯化后 LP69 CEP、LR22 CE图 3-17 乳杆菌 CEP 的 SDS-PAGE 电泳图-17 SDS-PAGE electrophoretograms of CEP from Lactob看出，经双水相萃取、超滤、Sephadex G-100 凝泳道上只出现了一条清晰的条带，对比标准蛋白分子量大约为45K Da，鼠李糖乳杆菌 LR22 CEP6 CEP 分子量约为30K Da，干酪乳杆菌 L61 CEP酸菌 CEP 分子量大小受菌株的影响。童敏[73]中提取 CEP，并对其粗酶液进行硫酸铵分级沉hadex G-100 凝胶层析后，得到了纯的 CEP。电验得到干酪乳杆菌 L61 分子量相近。PalenciaP 分子量约为 153K Da。同一乳杆菌不同菌株其球菌 LB12 中提取的 CEP 经分离纯化后其分人[20]从瑞士乳杆菌L89中提取的CEP分子量约
【参考文献】：
期刊论文
[1]杂交常绿卫矛与其父母本的抗寒生理特性比较[J]. 施征,任军,肖文发,张维诚,侯振宏,曾立雄. 林业科学研究. 2015(04)
[2]响应面法优化米曲霉蛋白酶的双水相萃取条件[J]. 黄福如,罗颖飞,张敏,杨海龙. 核农学报. 2014(10)
[3]嗜酸乳杆菌产胞壁蛋白酶的培养及发酵条件优化[J]. 任晓芬,潘道东,曾小群,赵紫微,朱丹丹. 中国食品学报. 2014(02)
[4]胞壁蛋白酶(CEP)酶解对酪蛋白结构及功能特性的影响[J]. 任晓芬,潘道东,曾小群,曹锦轩,孙杨赢. 现代食品科技. 2013(11)
[5]超滤技术分离双低油菜ACE抑制肽及其性能研究[J]. 田万敏,马海乐,骆琳,贾俊强,刘斌,何荣海. 中国粮油学报. 2011(09)
[6]双水相萃取技术在食品工业中应用[J]. 孙晨. 粮食与油脂. 2011(09)
[7]双水相法萃取生姜蛋白酶体系的建立[J]. 谢芳,唐晓珍,马明,杜新永,卢会忠. 食品与发酵工业. 2011(01)
[8]双水相体系萃取纤维素酶的研究[J]. 舒国伟,王长凤,陈合,杨志伟. 食品科技. 2010(12)
[9]双水相萃取法提取木瓜蛋白酶的研究[J]. 曹对喜,杜征,韩玉婷,余丽萍,刘坤逊,陈玉莹,段杉. 农产品加工(学刊). 2010(10)
[10]无花果蛋白酶在PEG/（NH4）2SO4双水相体系中的分配行为[J]. 冯自立,马娜. 食品科学. 2010(19)
博士论文
[1]羊乳源ACE抑制肽制备、分离纯化及鉴定[D]. 舒国伟.陕西科技大学 2016
硕士论文
[1]羊乳源抗氧化肽的分离纯化与结构鉴定及应用[D]. 高婷婷.陕西科技大学 2018
[2]植物乳杆菌LP69胞壁蛋白酶的制备及其应用研究[D]. 雷妮.陕西科技大学 2017
[3]木瓜蛋白酶的双水相萃取研究[D]. 王伟涛.海南大学 2014
[4]乳杆菌胞壁蛋白酶分离纯化及特性研究[D]. 童敏.宁波大学 2011
本文编号：2949267
【文章来源】：陕西科技大学陕西省
【文章页数】：91 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
乳酸杆菌蛋白水解体系的简化结构示意图
图 3-1 酪氨酸及蛋白质标准曲线Fig. 3-1 The standard curve of tyrosine and bovine serum albumin酪蛋白标准曲线回归方程为 y=0.01x+0.0012，R2=0.9996；蛋白质标准曲线回归方程为 y=0.0076x+0.0085，R2=0.9991，表明酪蛋白标准曲线及蛋白质标准曲线中的浓度与吸光度间有良好的线性关系。3.2 探究提取方法对乳杆菌胞壁蛋白酶的影响3.2.1 不同提取剂最适浓度的确定将四种益生乳杆菌 LP69、LR22、LB6 和 L61 菌体分别悬浮于表 2-3 所述的条件下培养，在 4℃下 4500r/min 离心 20min 后取上清液即为 CEP 粗酶液。通过一系列浓度梯度试验，测定粗酶液的酶活、蛋白含量及比活力，最终确定十种提取剂提取四种乳杆菌CEP 的最适浓度，结果见表 3-1。表 3-1 使用不同提取剂提取四种乳杆菌 CEP 的最适浓度Tab. 3-1 The optimal concentration of CEP obtained from different extraction agents提取方法四种乳杆菌 CEP 的最适浓度
-4 分别为 Sephadex G-100 纯化后 LP69 CEP、LR22 CE图 3-17 乳杆菌 CEP 的 SDS-PAGE 电泳图-17 SDS-PAGE electrophoretograms of CEP from Lactob看出，经双水相萃取、超滤、Sephadex G-100 凝泳道上只出现了一条清晰的条带，对比标准蛋白分子量大约为45K Da，鼠李糖乳杆菌 LR22 CEP6 CEP 分子量约为30K Da，干酪乳杆菌 L61 CEP酸菌 CEP 分子量大小受菌株的影响。童敏[73]中提取 CEP，并对其粗酶液进行硫酸铵分级沉hadex G-100 凝胶层析后，得到了纯的 CEP。电验得到干酪乳杆菌 L61 分子量相近。PalenciaP 分子量约为 153K Da。同一乳杆菌不同菌株其球菌 LB12 中提取的 CEP 经分离纯化后其分人[20]从瑞士乳杆菌L89中提取的CEP分子量约
【参考文献】：
期刊论文
[1]杂交常绿卫矛与其父母本的抗寒生理特性比较[J]. 施征,任军,肖文发,张维诚,侯振宏,曾立雄. 林业科学研究. 2015(04)
[2]响应面法优化米曲霉蛋白酶的双水相萃取条件[J]. 黄福如,罗颖飞,张敏,杨海龙. 核农学报. 2014(10)
[3]嗜酸乳杆菌产胞壁蛋白酶的培养及发酵条件优化[J]. 任晓芬,潘道东,曾小群,赵紫微,朱丹丹. 中国食品学报. 2014(02)
[4]胞壁蛋白酶(CEP)酶解对酪蛋白结构及功能特性的影响[J]. 任晓芬,潘道东,曾小群,曹锦轩,孙杨赢. 现代食品科技. 2013(11)
[5]超滤技术分离双低油菜ACE抑制肽及其性能研究[J]. 田万敏,马海乐,骆琳,贾俊强,刘斌,何荣海. 中国粮油学报. 2011(09)
[6]双水相萃取技术在食品工业中应用[J]. 孙晨. 粮食与油脂. 2011(09)
[7]双水相法萃取生姜蛋白酶体系的建立[J]. 谢芳,唐晓珍,马明,杜新永,卢会忠. 食品与发酵工业. 2011(01)
[8]双水相体系萃取纤维素酶的研究[J]. 舒国伟,王长凤,陈合,杨志伟. 食品科技. 2010(12)
[9]双水相萃取法提取木瓜蛋白酶的研究[J]. 曹对喜,杜征,韩玉婷,余丽萍,刘坤逊,陈玉莹,段杉. 农产品加工(学刊). 2010(10)
[10]无花果蛋白酶在PEG/（NH4）2SO4双水相体系中的分配行为[J]. 冯自立,马娜. 食品科学. 2010(19)
博士论文
[1]羊乳源ACE抑制肽制备、分离纯化及鉴定[D]. 舒国伟.陕西科技大学 2016
硕士论文
[1]羊乳源抗氧化肽的分离纯化与结构鉴定及应用[D]. 高婷婷.陕西科技大学 2018
[2]植物乳杆菌LP69胞壁蛋白酶的制备及其应用研究[D]. 雷妮.陕西科技大学 2017
[3]木瓜蛋白酶的双水相萃取研究[D]. 王伟涛.海南大学 2014
[4]乳杆菌胞壁蛋白酶分离纯化及特性研究[D]. 童敏.宁波大学 2011
本文编号：2949267
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/2949267.html
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