草鱼GPATCH3基因的克隆表达及其在先天免疫中的作用
发布时间：2021-01-04 19:30
G-patch结构域广泛存在于与RNA结合相关的蛋白中,该结构域约48个氨基酸残基,以富含甘氨酸（Gly）为主要特征。包含G-patch结构域的这些蛋白在不同组织中均有广泛表达,而且参与到先天免疫、mRNA转录后加工、发育和肿瘤增殖等生命活动中。其中,GPATCH3是一种在408-456位氨基酸包含此结构域,并在人体各组织广泛表达的蛋白。近年来,有研究发现人GPATCH3蛋白对RLR信号通路起着负调控的作用。此通路中,RIG-I和MDA5识别病毒的RNA并激发下游的一系列信号传递,使IRF3被磷酸化并入核,最终诱导I型干扰素（IFNI）的大量表达。之后,IFN作为信号分子可以诱导若干ISGs表达,发挥抗病毒功能。在对鱼类的研究中,与GPATCH3的相关报道仍十分稀少,多存在于基因组预测结果中。在对斑马鱼的研究中,发现敲除GPATCH3的个体在发育中出现了颅部畸形和眼部畸形。鱼类GPATCH3在先天免疫中的功能还没有报道。本实验以草鱼为材料,借由预测软件的辅助,在以脾脏组织为模板建立的cDNA文库中,成功克隆并获得了CiGPATCH3的mRNA序列。该基因mRNA全长为1646nt,其中...
【文章来源】：南昌大学江西省 211工程院校
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
RLR信号通路示意图
图 2.1 Western blot 电泳装置组装示意图Fig.2.1Assembly diagram of Western blot electrophoresis device2.10.3 洗膜与抗体孵育1)电转完毕，关掉电源，拆掉装置，将膜贴着分离胶的一面朝上放入干净的抗体孵育盒子中，做记号，正面朝上，右下角用铅笔点一个圆点，以免放反。置于脱色摇床上，加入 1×TBS 洗 2 次，每次 5 min。2)用移液管从孵育盒一侧加 10ml 5%封闭液，室温封闭 1 h。3)用 5%牛奶稀释一抗。例如 15ml 封闭液加入 5 μl anti-Flag M2(Sigma)，稀释比例 1:3000。4 ℃过夜孵育。4)第二天早上回收一抗，-20 ℃储存再用。用 10 ml 1×TBST buffer 洗膜 3次，每次 10 min。5)用 5 %牛奶封闭膜 45 min 后，将牛奶换掉。加入 1:5000 稀释的二抗，室温孵育 1 h。注意一抗的来源，选择合适的二抗，例如 anti-FlagM2(Sigma)是小鼠源的，二抗选择辣根酶标记山羊抗小鼠 IgG(1 mg/ml，中杉金桥)。
第三章 结果与分析第三章 结果与分析H3 mRNA 全长及序列分析脾脏组织为材料构建的 cDNA 作为模板，经分 mRNA 片段。测序后设计 5′RACE 和 3′R模板，扩增得到了相应片段(图 3.1)。测序后整 mRNA序列(图 3.2)。将序列用 DNAMAN7.，3′UTR 共 131nt，编码序列长 1221nt，蛋白大酸残基。
【参考文献】：
期刊论文
[1]重组干扰素上调草鱼干扰素系统基因的表达[J]. 余新建,李东明,马梅生,赖启南,胡成钰. 水生生物学报. 2013(06)
[2]草鱼肾脏组织细胞系CIK的建立（简报）[J]. 左文功,钱华鑫,许映芳,杜森英,杨先乐. 淡水渔业. 1984(02)
博士论文
[1]草鱼NF-κB信号通路激活及其调控的分子机制[D]. 王海舟.南昌大学 2017
[2]干扰素反应调控因子IRF3的入核机制研究[D]. 朱明珠.武汉大学 2015
硕士论文
[1]在内质网应激状态下草鱼PERK（EIF2AK3）通过磷酸化eIF2α降低细胞活性[D]. 张涛.南昌大学 2018
[2]草鱼IRF-2下调IFN、PKR、PKZ转录的分子机制[D]. 谷美慧.南昌大学 2015
[3]草鱼干扰素及其调节因子1和7[D]. 马梅生.南昌大学 2010
[4]鱼类几种免疫相关基因的克隆与鉴定[D]. 金红建.浙江大学 2002
本文编号：2957299
【文章来源】：南昌大学江西省 211工程院校
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
RLR信号通路示意图
图 2.1 Western blot 电泳装置组装示意图Fig.2.1Assembly diagram of Western blot electrophoresis device2.10.3 洗膜与抗体孵育1)电转完毕，关掉电源，拆掉装置，将膜贴着分离胶的一面朝上放入干净的抗体孵育盒子中，做记号，正面朝上，右下角用铅笔点一个圆点，以免放反。置于脱色摇床上，加入 1×TBS 洗 2 次，每次 5 min。2)用移液管从孵育盒一侧加 10ml 5%封闭液，室温封闭 1 h。3)用 5%牛奶稀释一抗。例如 15ml 封闭液加入 5 μl anti-Flag M2(Sigma)，稀释比例 1:3000。4 ℃过夜孵育。4)第二天早上回收一抗，-20 ℃储存再用。用 10 ml 1×TBST buffer 洗膜 3次，每次 10 min。5)用 5 %牛奶封闭膜 45 min 后，将牛奶换掉。加入 1:5000 稀释的二抗，室温孵育 1 h。注意一抗的来源，选择合适的二抗，例如 anti-FlagM2(Sigma)是小鼠源的，二抗选择辣根酶标记山羊抗小鼠 IgG(1 mg/ml，中杉金桥)。
第三章 结果与分析第三章 结果与分析H3 mRNA 全长及序列分析脾脏组织为材料构建的 cDNA 作为模板，经分 mRNA 片段。测序后设计 5′RACE 和 3′R模板，扩增得到了相应片段(图 3.1)。测序后整 mRNA序列(图 3.2)。将序列用 DNAMAN7.，3′UTR 共 131nt，编码序列长 1221nt，蛋白大酸残基。
【参考文献】：
期刊论文
[1]重组干扰素上调草鱼干扰素系统基因的表达[J]. 余新建,李东明,马梅生,赖启南,胡成钰. 水生生物学报. 2013(06)
[2]草鱼肾脏组织细胞系CIK的建立（简报）[J]. 左文功,钱华鑫,许映芳,杜森英,杨先乐. 淡水渔业. 1984(02)
博士论文
[1]草鱼NF-κB信号通路激活及其调控的分子机制[D]. 王海舟.南昌大学 2017
[2]干扰素反应调控因子IRF3的入核机制研究[D]. 朱明珠.武汉大学 2015
硕士论文
[1]在内质网应激状态下草鱼PERK（EIF2AK3）通过磷酸化eIF2α降低细胞活性[D]. 张涛.南昌大学 2018
[2]草鱼IRF-2下调IFN、PKR、PKZ转录的分子机制[D]. 谷美慧.南昌大学 2015
[3]草鱼干扰素及其调节因子1和7[D]. 马梅生.南昌大学 2010
[4]鱼类几种免疫相关基因的克隆与鉴定[D]. 金红建.浙江大学 2002
本文编号：2957299
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