短杆菌来源胆固醇氧化酶的重组表达及杂化纳米花固定化研究
发布时间：2021-01-09 16:11
胆固醇氧化酶（Cholesterol Oxidase,COD）是一种多功能生物酶,属于黄素蛋白氧化还原酶,该酶是生物细胞代谢过程中胆固醇降解的重要酶,被广泛应用于临床检测,农业,食品检测等领域。本研究将短杆菌Brevibacterium sp.来源的胆固醇氧化酶基因（cod）在大肠杆菌（Escherichia coli）中重组表达,研究了其酶学性质;对重组酶进行有机-无机杂化纳米花固定研究,考察了COD对不同底物的转化能力,并对产物进行了鉴定。（1）以含有Brevibacterium sp.来源cod基因的质粒pET28a-cod作为PCR模板,扩增cod基因,将其与质粒pRhamTM连接,并在宿主E.coli BL21（DE3）菌株中进行重组表达。使用7-氯-异咯嗪及黄素单核苷酸（FMN）为亲和配体填料的纯化柱进行纯化,获得比酶活25.23 U·mg-1的纯酶。酶学性质测定显示胆固醇氧化酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH为7.0,经差式扫描量热分析（DSC）,得到酶半变性温度为60.5℃。对诱导条件进行优化,当诱导剂浓度为0.25%时,...
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：65 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
胆固醇氧化酶催化过程
江南大学硕士学位论文结合。漆酶通过共价结合的方式固定在功能化的 SBA-15 介孔二OMW 的四种酚类化合物的水溶液，而且 10 个反应循环后仍有镁土纳米纤维作为支持材料与乙醇脱氢酶共价结合，底物的转在 2 小时内达到 88%和 99.2%，并且在 8 个循环后保留了约 4化方法具有所需时间较短、载体与酶分子不易分离等优点。然需条件较为剧烈致使酶活损失较高，而且载体可能结合到酶活。，每种固定方法都存在优点和缺点，选择最合适的固定化技术的检测模式。
江南大学硕士学位论文第三章 结果与讨论3.1 胆固醇氧化酶在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究3.1.1 重组表达载体的构建及验证E. coli. BL21/pET-28a 构建 COD 表达载体 pRhamTM-cod，构建流程见图 3-1。以质粒pET28a-cod 作为模板，PCR 扩增胆固醇氧化酶基因 cod，扩增过程引入酶切位点 Nde Ⅰ和 Not Ⅰ，如图 3-2(a)，PCR 条带大小与 cod 基因理论值相符，且条带单一，PCR 结果良好。按照 2.2.3 方法得到重组质粒 pRhamTM-T-cod，测序正确。重组质粒 pRhamTM-cod获得参考 2.2.4 方法，将获得的质粒采用 Nde Ⅰ和 Not Ⅰ双酶切，并通过核酸电泳进行验证，验证结果如图 3-2(b)所示，可看出其显示两条明显的条带，目的条带出现的位置分别与理论值 2575 bp 和 1524 bp 相符，证明重组质粒 pRhamTM-cod 构建成功。
【参考文献】：
期刊论文
[1]Cu-MOFs固定化酶制备及染料降解应用研究[J]. 高霞,张国春,乔成芳. 商洛学院学报. 2018(04)
[2]新型载体PEI修饰树脂固定化脂肪酶及其在对2-氯丙酸酯拆分中的应用[J]. 关锋. 橡塑技术与装备. 2016(06)
[3]比色法测定胆固醇氧化酶酶活[J]. 季文明,陈毅力,张和春,王武. 无锡轻工大学学报. 2000(03)
[4]用胆固醇氧化酶脱除猪油中的胆固醇[J]. 江正强,沈再春,阎巧娟. 中国农业大学学报. 1996(02)
硕士论文
[1]嗜热玫瑰红球菌肌氨酸氧化酶表达、结构及功能研究[D]. 郑梦玲.江南大学 2018
[2]CALB的固定化及其催化合成富含EPA/DHA甘油三酯的研究[D]. 刘向前.华南理工大学 2017
[3]固定化蛋白酶的制备及其在毛织物防毡缩整理中的应用[D]. 钟业桂.东华大学 2010
本文编号：2966986
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：65 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
胆固醇氧化酶催化过程
江南大学硕士学位论文结合。漆酶通过共价结合的方式固定在功能化的 SBA-15 介孔二OMW 的四种酚类化合物的水溶液，而且 10 个反应循环后仍有镁土纳米纤维作为支持材料与乙醇脱氢酶共价结合，底物的转在 2 小时内达到 88%和 99.2%，并且在 8 个循环后保留了约 4化方法具有所需时间较短、载体与酶分子不易分离等优点。然需条件较为剧烈致使酶活损失较高，而且载体可能结合到酶活。，每种固定方法都存在优点和缺点，选择最合适的固定化技术的检测模式。
江南大学硕士学位论文第三章 结果与讨论3.1 胆固醇氧化酶在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究3.1.1 重组表达载体的构建及验证E. coli. BL21/pET-28a 构建 COD 表达载体 pRhamTM-cod，构建流程见图 3-1。以质粒pET28a-cod 作为模板，PCR 扩增胆固醇氧化酶基因 cod，扩增过程引入酶切位点 Nde Ⅰ和 Not Ⅰ，如图 3-2(a)，PCR 条带大小与 cod 基因理论值相符，且条带单一，PCR 结果良好。按照 2.2.3 方法得到重组质粒 pRhamTM-T-cod，测序正确。重组质粒 pRhamTM-cod获得参考 2.2.4 方法，将获得的质粒采用 Nde Ⅰ和 Not Ⅰ双酶切，并通过核酸电泳进行验证，验证结果如图 3-2(b)所示，可看出其显示两条明显的条带，目的条带出现的位置分别与理论值 2575 bp 和 1524 bp 相符，证明重组质粒 pRhamTM-cod 构建成功。
【参考文献】：
期刊论文
[1]Cu-MOFs固定化酶制备及染料降解应用研究[J]. 高霞,张国春,乔成芳. 商洛学院学报. 2018(04)
[2]新型载体PEI修饰树脂固定化脂肪酶及其在对2-氯丙酸酯拆分中的应用[J]. 关锋. 橡塑技术与装备. 2016(06)
[3]比色法测定胆固醇氧化酶酶活[J]. 季文明,陈毅力,张和春,王武. 无锡轻工大学学报. 2000(03)
[4]用胆固醇氧化酶脱除猪油中的胆固醇[J]. 江正强,沈再春,阎巧娟. 中国农业大学学报. 1996(02)
硕士论文
[1]嗜热玫瑰红球菌肌氨酸氧化酶表达、结构及功能研究[D]. 郑梦玲.江南大学 2018
[2]CALB的固定化及其催化合成富含EPA/DHA甘油三酯的研究[D]. 刘向前.华南理工大学 2017
[3]固定化蛋白酶的制备及其在毛织物防毡缩整理中的应用[D]. 钟业桂.东华大学 2010
本文编号：2966986
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