人羧肽酶B的异源表达、纯化及其酶活研究

发布时间：2021-01-11 23:26

　　羧肽酶B（carboxypeptidase B,CPB）是一类水解蛋白或多肽底物的金属蛋白酶,它作为一种重要的工具酶被应用于胰岛素等产品的加工。近年来,毕赤酵母表达系统发展迅速、应用广泛、高密度发酵技术成熟、生产过程简单、且利于规模化生产。本研究试图构建重组人CPB酶原的毕赤酵母表达系统,同时,建立较系统而规模化的发酵和纯化生产工艺,以得到高纯度、高活性的重组人CPB产品。本文将酶切得到的PCPB目的基因片段与pPIC9载体进行连接,得到重组质粒pPIC9-PCPB,再转入毕赤酵母GS115,构建重组人CPB酶原毕赤酵母表达菌株。将构建得到的菌株经活化后转接到BMGY摇瓶培养基中,在温度30℃,摇床转数200rpm条件下,每24h补加终体积1%的甲醇诱导,诱导72h后,筛选出表达量最高的重组人CPB酶原毕赤酵母表达菌株。优化得到重组人CPB酶原种子培养基:胰蛋白胨20g/L,酵母抽提物10g/L,甘油10g/L,磷酸二氢钾1.2g/L,十二水磷酸氢二钠2.2g/L,消泡剂25μl/L。在温度30℃、转数220rpm条件下培养24小时左右,重组人CPB酶原种子菌体OD600可以达到10～... 

【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：61 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图２．２?ｐＰＩＣ９－ＰＣＰＢ重组质粒的酶切鉴定图谱??Ｍ：标准ＤＮＡ；?１，?２：经Ｘｈｏｌ和Ｎｏｔｌ双酶切后重组质粒样品??

切胶回收ＰＣＰＢ目的基因片段，与经过同样的酶双酶切并切胶回收的??ｐＰＩＣ９载体大片段进行连接，然后转化感受态大肠杆菌ＤＨ５ａ，重组质粒命名为??ｐＰＩＣ９－ＰＣＰＢ。ｐＰＩＣ９－ＰＣＰＢ重组质粒的构建过程如图２．１所示。重组质粒酶切电??泳结果见图２．２。结果显示重组质粒经过Ｘｈｏｌ和Ｎｏｔｌ双酶切后，可以得到１３００ｂｐ??左右的目的片段和８０００ｂｐ左右的载体片段，与理论值相符。重组质粒测序结果??显示，所测目的基因序列与基因合成理论序列相一致，表达载体构建成功。??ｒ－－…－－????？＞（，１」＇？？一????ｐＰＩＣ９?ＰＣＰＢ??１?Ｘｌｄ＾ＮｏｌＩ?［￣］?Ｘｌｉｃｉ＾ＮｏＵ??＇?一??ｐＰＩＣ９?ＤＮＡ?ｈ｜ｐｉ＊ｃ?ｒｙ?ＰＣＰＢ??ｖ感＃??ＰＰ１Ｃ９－ＰＣＰＢ??图２．１?ｐＰｌＣ９－ＰＣＰＢ重组质粒的构建过程图??Ｆｉｇ．２．１?Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ?ｐｒｏｃｅｓｓ?ｏｆ?ｐＰＩＣ９－ＰＣＰＢ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｅ?ｐｌａｓｍｉｄ??ｆｃ＞ｐ?ＩＶＩ?１?２??８０００——Ｐ??５０００?——Ｈ??３０００??１??２０００——■??０．０００——■??图２．２?ｐＰＩＣ９－ＰＣＰＢ重组质粒的酶切鉴定图谱??Ｍ：标准ＤＮＡ；?１，?２：经Ｘｈｏｌ和Ｎｏｔｌ双酶切后重组质粒样品??Ｆｉｇ．２．２?Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｐＰＩＣ９－ＰＣＰＢ??Ｍ：ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ；?１，２：Ｄｉｇｅｓｔｅｄ?

１２?第２章重组人ＣＰＢ酶原酵母表达菌株的构建??２．４．２重组质粒ＰＰＩＣ９－ＰＣＰＢ的导入??鉴定结果见图２．３。结果显示１４个重俎子（１号至１４号）与阳性对照组均能??够扩增出１４００ｂｐ左右目的基因片段，而阴性对照组（１５号）无法扩增出目的基??因片段。说明重组质粒ＰＰＩＣ９－ＰＣＰＢ已经成功整合到了?ＧＳ１１５宿主基因组中。??ｂｐ?Ｍ?１?２?３?ａ?５?６?７?Ｓ?Ｂ?ｌＯ?１１?１２?１３?Ｘ４?１５?２６??５０００???３０００???２０００???１５００一??７５０—??ｎＨＨＨＨＨＨＩ??图２．３?ｐＰＩＣ＾ＰＣｒｏ／ＧＳ?Ｕ?５的菌落ＰＣＲ鉴定图谱??Ｍ：标准ＤＮＡ；?１？１４：】４个ＰＣＲ重组子样品；］５：阴性对照；１６：阳性对照；??Ｆｉｇ．２．３?Ｃｏｌｏｎｙ?ＰＣＲ?ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｐＰＩＣ９－ＰＣＰＢ／ＧＳ?１１５??Ｍ：ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ；ｌ￣１４：ＰＣＲ?ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ?ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆ?１４?ｓａｍｐｌｅｓ；?１５：Ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ；??１６：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ??２．４．３重组人ＣＰＢ酶原毕赤酵母表达菌株的筛选??电泳结果见图２．４。结果显示，８个样品均有目的蛋白表达，其中７号表迗量??相对较高，因此将７号样品活化后进行菌种保藏，准备进行发酵工艺优化研究。??ｋＥ＞ａ?Ｍｌ?２?３?４?５?６７?８??：：：＝?＿??ｉｓ．ａ＿＿感麻寒編??—Ｂ??图２．４?ｐＰＩＣ９－ＰＣＰＢ／ＧＳ?１１


本文编号：2971677