乙脑病毒包膜蛋白279位氨基酸突变对病毒神经毒力的影响

发布时间：2021-02-11 04:01

　　目的:构建乙脑病毒（JEV）野毒株SA14包膜蛋白K279M突变病毒感染性克隆,拯救病毒,并用动物实验探讨JEV包膜蛋白279位氨基酸突变对病毒神经毒力的影响。方法:以JEV包膜蛋白cDNA为模板,用重叠延伸PCR技术与分子克隆技术构建含有rJEV SA14包膜蛋白279位氨基酸,由赖氨酸（K）突变为甲硫氨酸（M）的全长cDNA质粒pACNR-JEV SA14（K279M）,并以其为模板体外转录获得RNA,转染BHK21细胞进行病毒包装得到恢复病毒JEV SA14（K279M）。用蚀斑实验、间接免疫荧光实验以及病毒测序等方法鉴定恢复病毒。比较恢复病毒JEV SA14（K279M）和rJEV SA14、突变株JEV SA14-14-2（M279K）、乙脑疫苗株（rJEV SA14-14-2）的蚀斑大小、生长特点以及对昆明鼠和7日龄乳鼠的神经毒力等方面的差异。结果:感染性克隆经酶切、测序鉴定表明已成功构建。病毒测序结果表明:恢复病毒JEV SA14（K279M）除在1813位碱基处人为引入A→T的突变（导致K279M突变）外,未发生其它突变。经间接免疫荧光实验证实,恢复病毒JEV SA14... 

【文章来源】：川北医学院四川省

【文章页数】：60 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

含E279突变的JEVSA14（K279M）感染性克隆的构建Fig1.ConstructionflowchartofinfectioncloneofJEVSA14(K279M)virus

图 2 重叠延伸 pcr 技术扩增含 279 突变 DNA 片段示意图Fig2. Construction flow chart of 279 mutated DNAfragments by SOE PCR.2.1.3 prM/E (K279M)片段的 T-A 克隆及测序鉴定① 连接反应将回收的DNA片段与pMD-19T载体按表2进行体外连接，4℃过夜pMD-19 T Vector 1.0ulSolution I 5.0ulH2O 2.0ul② 蓝白斑实验将 X-Gal（20mg/ml）、IPTG（1mol/l）、LB 液体培养基按比例 40ulul：100ul 混合，均匀涂布在 LB 固体培养基平板（含有 100mg/ml AM

及死亡情况 14d，其中，前 3 天死亡 法分别计算 JEV SA14-14-2 (M279 扩增含 E279 突变的 prM/E 片段E279R 配对扩增产物约为 1400bp， 800bp，用引物 F2 和 R3 配对扩增乳鼠，每组 6 只，每只乳鼠接种

【参考文献】：
期刊论文
[1]乙脑病毒野毒株SA14感染性克隆的构建及病毒拯救[J]. 冷生玲,黄荣,冯亚岚,唐丽萍,周仲辉,陈大斌,杨健.  中国病原生物学杂志. 2018(09)
[2]乙型脑炎疫苗株SA14-14-2包膜蛋白279位氨基酸回复突变对其毒力的影响[J]. 杨健,李玉华,李竹石,林华,汪伟,刘丽娜,倪谦枝,曾献武,杨会强.  川北医学院学报. 2013(04)
[3]乙型脑炎病毒SA14-14-2减毒疫苗株的生物学和基因稳定性[J]. 许乐燕,徐闻青,徐帆洪,王兵,张秀娟.  中国生物制品学杂志. 2008(10)



本文编号：3028489