利用CRISPR/Cas9技术创制大豆高油酸突变系
发布时间：2021-02-10 21:12
大豆是重要的油料兼经济作物。大豆油中富含多不饱和脂肪酸,容易被氧化。油酸作为一种单不饱和脂肪酸,是大豆油的重要组成部分,它性质稳定、不容易被氧化,在人体的脂类代谢中能降低有害胆固醇,保持有益胆固醇,从而减缓动脉粥样硬化,有效预防心血管疾病发生的几率。因此,油酸含量是评价大豆油脂品质的重要指标,高油酸大豆育种是大豆品质育种的重要目标之一。在脂肪酸合成途径中,Δ12-脂肪酸脱饱和酶（FAD2）是催化油酸转化为亚油酸的关键酶。FAD2-1A和FAD2-1B基因主要在发育的种子中表达,并被认为在控制种子油酸含量中起着重要作用。本研究利用CRISPR/Cas9技术定向编辑控制油酸含量的两个关键基因GmFAD2-1A和GmFAD2-1B,创制大豆FAD2-1基因突变体,为高油酸育种提供了新的种质资源并创建了方法。主要研究结果如下:1.根据大豆GmFAD2-1A和GmFAD2-1B基因的序列,同时设计了3个分别由AtU3d、AtU3b和AtU6-1启动子驱动、长20 bp的guide RNA（gRNA）靶点以靶向编辑GmFAD2-1A和GmFAD2-1B基因的外显子区,并且将这...
【文章来源】：广州大学广东省
【文章页数】：75 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图2-13个靶点分别在GmFAD2-1基因内的位置
第二章 实验材料与方法暗条件下培养 20 d 左右。发根诱导培养基（1 L）：1/2 MS，MES 0.6脂 8 g，250 mg L-1头孢，250 mg L-1羧苄霉素，PH=5.8。转 pYLCRISPR/Cas9-FAD2-1-gRNA 大豆毛状根的筛选及培养发 5~7 d 后，选取绿色的大豆无菌苗，将获得的大豆子叶节外植体放入 中 ， 用 制 备 好 的 农 杆 菌 K599 菌 液 pYLCRISPR/Cas9-FAD2RISPR/Cas9-FAD2-1-gRNA-1，pYLCRISPR/Cas9-FAD2-1-gRNA-2）侵25℃，16 h/8 h 光暗条件下培养，直至长出毛状根，转化过程如下（图
图 3-2 pYLCRISPR/Cas9-FAD2-1-gRNA 表达载体的构建第二轮 PCR 扩增；M：DNA marker（DM2000）；1：是含有第 1 有第 2 个靶位点的 AtU3b 表达盒；3：是含有第 3 个靶位点的 A泳；M：DNA marker（DM2000）；1：H2O 空白对照；2：pYL2-1 基因敲除阳性单菌落。D：Asc I 酶切鉴定 pYLCRISPR/Cas9M：1 kb DNA ladder marker；1：pYLCRISPR/Cas9-FAD2-1-gRN. 3-2 Construction of pYLCRISPR/Cas9-FAD2-1-gRNA expression d second rounds of PCR amplification; M: DNA marker (DM2000); 1ntaing the second target site; 3: containg the three target site. C: electry; M: DNA marker (DM2000); 1: H2O blank control; 2: pYLCRISPR/-7: FAD2-1 gene knockout positive single clones. D: identification of R/Cas9-FAD2-1-gRNA plasmid digested with Asc I; M: 1 kb DNA ladpYLCRISPR/Cas9-FAD2-1-gRNA.
【参考文献】：
期刊论文
[1]反义RNA介导GmFAD2-1B基因沉默增强大豆种子中油酸的高效累积[J]. 杨静,邢国杰,牛陆,贺红利,杜茜,郭东全,袁英,杨向东. 作物学报. 2017(11)
[2]农杆菌介导大豆子叶节转化法外植体选择新方法[J]. 王爽,郭兵福,张丽娟,郭勇,金龙国,杨慧,邱丽娟. 大豆科学. 2016(05)
[3]TALEN-Mediated Homologous Recombination Produces Site-Directed DNA Base Change and Herbicide-Resistant Rice[J]. Ting Li,Bo Liu,Chih Ying Chen,Bing Yang. Journal of Genetics and Genomics. 2016(05)
[4]运用CRISPR/Cas系统对植物基因组进行定点编辑[J]. 宋时奎,王影,于洋,耿立召,张春翔,李相敢,韩天富. 分子植物育种. 2014(06)
[5]CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术[J]. 方锐,畅飞,孙照霖,李宁,孟庆勇. 生物化学与生物物理进展. 2013(08)
[6]大豆脂肪酸组份相关、变异特点分析[J]. 宋晓昆,张颖君,闫龙,杨春燕,郑艳艳,蒋春志,荆慧贤,张孟臣,黄占景. 华北农学报. 2010(S2)
[7]农杆菌介导大豆子叶节转化系统的优化[J]. 李文霞,宁海龙,吕文河,李文滨. 中国农业科学. 2008(04)
[8]农杆菌介导的花生Δ12脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2 RNAi抑制表达遗传转化研究[J]. 张小茜,单雷,唐桂英,滕娜,毕玉平. 中国油料作物学报. 2007(04)
[9]油菜脂肪酸品质改良的研究进展[J]. 邬贤梦,官春云,李栒. 作物研究. 2003(03)
[10]大豆基因型对根癌农杆菌菌株敏感性的研究[J]. 王罡,王萍,蔺宇,张领兵,吴颖. 遗传. 2002(03)
博士论文
[1]靶向干扰Diaph1表达对脑胶质瘤细胞增殖、凋亡、迁移的影响及分子机制的研究[D]. 张灿.上海大学 2016
本文编号：3027994
【文章来源】：广州大学广东省
【文章页数】：75 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图2-13个靶点分别在GmFAD2-1基因内的位置
第二章 实验材料与方法暗条件下培养 20 d 左右。发根诱导培养基（1 L）：1/2 MS，MES 0.6脂 8 g，250 mg L-1头孢，250 mg L-1羧苄霉素，PH=5.8。转 pYLCRISPR/Cas9-FAD2-1-gRNA 大豆毛状根的筛选及培养发 5~7 d 后，选取绿色的大豆无菌苗，将获得的大豆子叶节外植体放入 中 ， 用 制 备 好 的 农 杆 菌 K599 菌 液 pYLCRISPR/Cas9-FAD2RISPR/Cas9-FAD2-1-gRNA-1，pYLCRISPR/Cas9-FAD2-1-gRNA-2）侵25℃，16 h/8 h 光暗条件下培养，直至长出毛状根，转化过程如下（图
图 3-2 pYLCRISPR/Cas9-FAD2-1-gRNA 表达载体的构建第二轮 PCR 扩增；M：DNA marker（DM2000）；1：是含有第 1 有第 2 个靶位点的 AtU3b 表达盒；3：是含有第 3 个靶位点的 A泳；M：DNA marker（DM2000）；1：H2O 空白对照；2：pYL2-1 基因敲除阳性单菌落。D：Asc I 酶切鉴定 pYLCRISPR/Cas9M：1 kb DNA ladder marker；1：pYLCRISPR/Cas9-FAD2-1-gRN. 3-2 Construction of pYLCRISPR/Cas9-FAD2-1-gRNA expression d second rounds of PCR amplification; M: DNA marker (DM2000); 1ntaing the second target site; 3: containg the three target site. C: electry; M: DNA marker (DM2000); 1: H2O blank control; 2: pYLCRISPR/-7: FAD2-1 gene knockout positive single clones. D: identification of R/Cas9-FAD2-1-gRNA plasmid digested with Asc I; M: 1 kb DNA ladpYLCRISPR/Cas9-FAD2-1-gRNA.
【参考文献】：
期刊论文
[1]反义RNA介导GmFAD2-1B基因沉默增强大豆种子中油酸的高效累积[J]. 杨静,邢国杰,牛陆,贺红利,杜茜,郭东全,袁英,杨向东. 作物学报. 2017(11)
[2]农杆菌介导大豆子叶节转化法外植体选择新方法[J]. 王爽,郭兵福,张丽娟,郭勇,金龙国,杨慧,邱丽娟. 大豆科学. 2016(05)
[3]TALEN-Mediated Homologous Recombination Produces Site-Directed DNA Base Change and Herbicide-Resistant Rice[J]. Ting Li,Bo Liu,Chih Ying Chen,Bing Yang. Journal of Genetics and Genomics. 2016(05)
[4]运用CRISPR/Cas系统对植物基因组进行定点编辑[J]. 宋时奎,王影,于洋,耿立召,张春翔,李相敢,韩天富. 分子植物育种. 2014(06)
[5]CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术[J]. 方锐,畅飞,孙照霖,李宁,孟庆勇. 生物化学与生物物理进展. 2013(08)
[6]大豆脂肪酸组份相关、变异特点分析[J]. 宋晓昆,张颖君,闫龙,杨春燕,郑艳艳,蒋春志,荆慧贤,张孟臣,黄占景. 华北农学报. 2010(S2)
[7]农杆菌介导大豆子叶节转化系统的优化[J]. 李文霞,宁海龙,吕文河,李文滨. 中国农业科学. 2008(04)
[8]农杆菌介导的花生Δ12脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2 RNAi抑制表达遗传转化研究[J]. 张小茜,单雷,唐桂英,滕娜,毕玉平. 中国油料作物学报. 2007(04)
[9]油菜脂肪酸品质改良的研究进展[J]. 邬贤梦,官春云,李栒. 作物研究. 2003(03)
[10]大豆基因型对根癌农杆菌菌株敏感性的研究[J]. 王罡,王萍,蔺宇,张领兵,吴颖. 遗传. 2002(03)
博士论文
[1]靶向干扰Diaph1表达对脑胶质瘤细胞增殖、凋亡、迁移的影响及分子机制的研究[D]. 张灿.上海大学 2016
本文编号：3027994
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3027994.html
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