CRISPR/Cas9技术介导的RNA甲基转移酶NSUN2基因敲除及其功能研究

发布时间：2021-02-09 21:20

　　5-甲基胞嘧啶（m5C）作为RNA的一种普遍的修饰近年来得到广泛的关注。越来越多的研究表明,RNAm5C修饰在RNA加工、RNA稳定性、RNA出核转运以及mRNA翻译等过程中起到重要作用。NSUN2（NOP2/Sun domain family,member 2）是哺乳动物RNAm5C甲基转移酶之一,主要负责tRNA和mRNA的甲基化。最近研究表明,NSUN2参与调节生物体的发育及疾病的发生,如细胞增殖、干细胞分化、脑和睾丸发育以及肿瘤发生等。但对NSUN2在生物体发育和疾病发生中的作用和功能及其分子机制仍不甚明了。本研究以肾小管上皮细胞系HEK293和肝癌细胞系HepG2为研究模型,通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术敲除NSUN2基因,观察NSUN2敲除后细胞的表型、基因表达和mRNA m5C修饰的变化,进而阐明NSUN2基因及其RNA m5C修饰的生物学功能和作用。1.利用CRISPR/Cas9技术建立RNA m5C甲基转移酶NSUN2基因缺失型HEK293和HepG2细胞系本研究通过CRISPR/Cas9技术介导的同源重组将抗性筛选标记（NeoR和PuroR）及转录终止... 

【文章来源】：扬州大学江苏省

【文章页数】：147 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

图２－１?ＮＳＵＮ２去表达细胞系建立示意图

图２－２?Ｄｏｎｏｒ载体工作原理示意图。Ｃａｓ９切割基因组靶位点后，Ｄｏｎｏｒ载体利用同源修复机制，将左??右同源臂中间的筛选基因和转录终止信号从切割位点整合入基因组。??Ｆｉｇ．２－２?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｄｏｎｏｒ?ｖｅｃｔｏｒ．?Ａｆｔｅｒ?ｔａｒｇｅｔ?ｓｉｔｅ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｇｅｎｏｍｅ?ｗａｓ?ｃｕｔｔｅｄ?ｂｙ?Ｃａｓ９?ｐｒｏｔｅｉｎ，?ｄｏｎｏｒ??ｃａｒｒｉｅｒｓ?ｉｎｔｅｇｒａｔｅ?ｔｈｅ?ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ?ｇｅｎｅｓ?ａｎｄ?ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ?ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ?ｓｉｇｎａｌ?ｂｅｔｗｅｅｎ?ｔｈｅ?ｌｅｆｔ?ａｎｄ?ｒｉｇｈｔ??ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ?ａｒｍ?ｉｎｔｏ?ｔｈｅ?ｃｕｔｔｉｎｇ?ｓｉｔｅ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｇｅｎｏｍｅ?ｔｈｒｏｕｇｈ?ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ?ｒｅｐａｉｒ?ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．??Ｄｏｎｏｒ载体骨架为Ｔ?ｅａｓｙ?ｖｅｃｔｏｒ－ｍｕｌｔｉ－５，是由Ｔ－ｖｅｃｔｏｒ改造而来，其中插入一段有两??个＆ｗＢｌ酶切位点的序列。Ｄｏｎｏｒ序列主要组成为ＮＳＵＮ２－ＬＲ?（左同源臂）、Ｔ２Ａ－筛选基因??和？《／＃）、转录终止信号（ＢＧＨｐｌｏｙ（Ａ）?ｓｉｇｎａｌ）、ＮＳＵＮ２－ＲＲ?（右同源臂）。主要构建??方法如下：??（１）左右同源臂的扩增，左右同源臂分别扩增于ＮＳＵＮ２基因ｇＲＮＡ切割位点上游和下游??各８００?ｂｐ序列，引物如下：???引物名称?序列（５，－３，）???ＨＡＬ－Ｂｓａ?１?－Ｆ?ＴＴＴＧＣＴＣＡＧＧＴＣＴＣＡＣＴＣＴＧＴＧＧＣＴＧＧＧＣ?ＡＧＣＧＣＧ??

４．１成功构建针对人ＮＳＵＮ２基因的ｓｇＲＮＡ??本文利用在线网站在ＮＳＵＮ２基因第一和第二外显子上设计并挑选出５个错配率低的??ｇＲＮＡ位点（图２－３）。为检测各ｓｇＲＮＡ的定位效率，我们将ｓｇＲＮＡ和Ｃａｓ９质粒共转染至??ＨＥＫ２９３细胞系，在提取基因组和ＰＣＲ扩增靶序列后，用Ｔ７Ｅ１酶切法确定各位点切割效??率。??Ｔｅ＊ｔ－Ｆ?Ｔｅｔｔ－Ｒ??Ｈｈ－ｆ?＋?Ｉ－－－４?１?１－?４?Ｈ－．?ｌ?轚Ｉ?Ｉ－Ｉ?Ｉ?Ｉ－?？??ｇｌＬＮＡ初卿??ｗ??ｇＲＮＡ－４??ｆＲＮＡ－ｌ??ｊ??｜ＲＮＡ－Ｓ?Ｈｏｍｏ?ｓｄｐｉｅｉｉ？?ＮＯＰ？?Ｓｕｎ?ＲＮＡ?ｍｅｌｈｙｔｔｒ？ｎ？ｆ＜＾ｒｄｓｃ?ｆ＾ｍ＆ｙ?ｍｅｍｂｅｒ?７?（ＮＳＵＮ？）??图２－３?ｇＲＮＡ位点和检测引物在ＮＳＵＮ２基因组上位置示意图。??Ｆｉｇ．２－３?Ｔｈｅ?ｌｏｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｇＲＮＡ?ｌｏｃｉ?ａｎｄ?ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ?ｐｒｉｍｅｒｓ?ｉｎ?ＮＳＵＮ２?ｇｅｎｅ．??


本文编号：3026253