热稳定性丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶异源表达及其在乙酰辅酶A合成中的应用

发布时间：2021-02-25 13:24

　　乙酰辅酶A被广泛应用到生物医学研究中,使用TPP代替昂贵的ATP为辅因子合成乙酰辅酶A受到广泛关注。新阿波罗栖热袍菌（Thermotoga neapolitana）来源的丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶（Tn PFOR）在大肠杆菌中进行了重组表达,分析了其酶学特性,并探讨了利用嗜热酶（TnPFOR）酶法合成乙酰辅酶A。采用pET-20b（+）载体,将新阿波罗栖热袍菌来源的四亚基组成的嗜热酶（Tn PFOR）在大肠杆菌中进行异源表达;通过热处理和阴离子交换层析法纯化嗜热酶（TnPFOR）;重组表达的嗜热酶（TnPFOR）的最适反应温度和pH分别为90℃和6. 5,TnPFOR在90℃下孵育1h时保留了50%活性。利用嗜热酶（Tn PFOR）,以TPP为辅酶合成了乙酰辅酶A,并探讨了不同温度、丙酮酸钠底物浓度和反应时间对乙酰辅酶A合成的影响。得到的优化条件为:最适反应温度为90℃,丙酮酸钠浓度为1. 5mmol/L,反应时间为2min。 

【文章来源】：中国生物工程杂志. 2020,40(03)北大核心

【文章页数】：7 页

【部分图文】：

Tn PFOR酶四个亚基共表达示意图

探讨了不同温度、pH和氧气对重组丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶的影响。如图4所示，重组表达的TnPFOR酶的最适反应温度为90℃，最适反应p H为6.5。PFOR酶在90℃下孵育1h后，仍剩余50%以上的酶活，有很好的热稳定性。并且在85℃下孵育1h时保留了80%以上的活性。重组表达的TnPFOR酶对氧敏感，当TnPFOR酶在室温下长时间暴露于空气中时，暴露2h后其活性逐渐下降约50%，在室温下放置3h时，下降了60%左右的酶活性，空气中暴露5h后，重组TnPFOR酶活性降低了近80%的活性。说明该酶对氧气敏感，有氧条件下容易失活(图4d)。而来源于柠檬酸菌的PFOR酶最适反应温度为50℃，该酶在50℃的半衰期为33min，为了提高酶的稳定性，需要对酶进行固定化，固定化后的酶催化活力明显下降。图3 重组丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶表达和纯化SDS-PAGE(a)和Native-PAGE(b)电泳图谱

图2 丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶基因PCR扩增结果(a)和重组质粒p ET-PFOR双酶切验证胶图(b)通过加入不同浓度的乙酰辅酶A(0.01～0.1mmol/L)，反应体系中添加等量的酶，丙酮酸钠浓度为1mmol/L，在p H 8.0和温度90℃条件下反应，采用Lineweaver-Burk双倒数作图法，求得重组TnPFOR酶对乙酰辅酶A的Km值为25μmol/L,Vmax为28.6U/mg。

【参考文献】：
期刊论文
[1]大肠杆菌基因组中重叠基因注释的机器学习优化方法[J]. 杜明伦,黄君君,马香,唐燕琼,刘柱.  中国生物化学与分子生物学报. 2018(08)
[2]超嗜热酯酶EST2在不同宿主中的异源高效表达研究[J]. 罗漫杰,谢渊,钱志刚,冯雁,杨广宇.  中国生物工程杂志. 2014(12)
[3]大肠杆菌多基因共表达策略[J]. 马蓉,徐昊,丁锐,敖永华,张立军.  中国生物工程杂志. 2012(04)
[4]大肠杆菌高效表达重组蛋白策略[J]. 任增亮,堵国成,陈坚,吴敬.  中国生物工程杂志. 2007(09)



本文编号：3051038