布鲁氏菌蛋白BMEI0340调控炎性因子表达及免疫原性研究
发布时间：2021-02-26 11:39
布鲁氏菌引起的布鲁氏菌病是一种自然疫源性传染病,可引起多种动物和人感染,危害极其严重。布鲁氏菌的致病性主要表现为炎性因子造成的炎症损伤,其中发挥关键作用的是Ⅳ型分泌系统（T4SS）,然而T4SS的功能是由分泌蛋白介导的。前期研究证明BMEI0340蛋白是T4SS的分泌蛋白,通过比对分析发现:该蛋白与多种细菌中调节炎性因子表达的脂蛋白Pal同源,因此推断该蛋白可能与调节炎性因子表达有关。另外有大量研究表明:脂蛋白Pal具有良好的免疫原性。本研究通过实验确定分泌蛋白BMEI0340是否参与调控炎性因子表达,进而鉴定其关键功能区,并对该蛋白免疫原性进行研究。本研究从以下两方面进行开展,结果如下:1.确定分泌蛋白BMEI0340是否参与调控炎性因子表达并鉴定其关键功能区利用BMEI0340蛋白编码基因序列设计引物,PCR扩增BMEI0340基因,构建重组表达质粒化转感受态细胞,诱导表达蛋白。经WB验证表达后,将BMEI0340蛋白纯化,获得高纯度蛋白刺激鼠源巨噬细胞,测定炎性因子的表达水平。结果显示:BMEI0340蛋白可以上调与布鲁氏菌病发生、发展密切相关的细胞因子TNF-α的表达。为确定上...
【文章来源】：河北科技师范学院河北省
【文章页数】：69 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
BMEI0340序列分析
第二章确定分泌蛋白BMEI0340对炎性因子的调节进而鉴定其关键功能区292.3分泌蛋白BMEI0340截短表达为确定该蛋白影响细胞因子表达的关键功能区，将BMEI0340蛋白进行截短表达，截短表达方案如下。图2-1BMEI0340蛋白截短表达方案Fig.2-1truncatedexpressionofBMEI0340protein根据截短方案的要求，利用引物设计软件设计引物，向赛百胜公司提交订单合成引物。将尾部截短40个氨基酸后表达的蛋白命名为24蛋白，头部截短46个氨基酸后表达的蛋白命名为70蛋白。用于扩增24蛋白、70蛋白编码的基因引物见表2-6。表2-624、70蛋白引物信息Table2-624,70Proteinprimerinformation将24蛋白、70蛋白编码的基因构建到克隆载体pET32上，然后通过PCR、双酶切验证其成功表达后，分别提取24蛋白、70蛋白阳性质粒转化到TransB(DE3)感受态细胞中，利用原核表达系统诱导表达蛋白，经SDS-PAGE引物名称引物序列酶切位点扩增片段长24-FATGGATCCGGCTGTGCGTCAAAGAAGAACBamHI318bp24-RAAAAGCTTCGGCACACCGCGCGAAGCGAGGAAGTHindIII70-FAAGGATCCATCCGCGCCGATGCGCAGCAGACGCTBamHI300bp70-RAAAAGCTTTTACCGTCCGGCCCCGTTGAHindIII
第二章确定分泌蛋白BMEI0340对炎性因子的调节进而鉴定其关键功能区30和Westernblot分析24蛋白、70蛋白是否成功表达。确认表达后大量诱导表达，超声裂解菌体，分离上清、沉淀SDS-PAGE电泳确定其表达形式，并利用合适的纯化方式对蛋白进行纯化，除去干扰物质和细菌，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定24、70蛋白的浓度，分装于PCR小管中放于-20℃备用，将24蛋白、70蛋白梯度稀释，同时设置阴性、阳性对照作用细胞，测定其炎性因子表达水平，通过分析数据确定其影响细胞因子表达的关键区段，具体操作同2.2.1-2.2.5。2.4结果2.4.1分泌蛋白BMEI0340编码基因的扩增以灭活的布鲁氏菌核酸为模板,利用表2-1中引物0340-F,0340-R成功扩增出该蛋白的编码基因，与预期大小一致，条带单一，扩增良好，如图2-2。图2-2PCR扩增分泌蛋白BMEI0340编码基因Fig.2-2PCRamplificationofsecretoryproteinBMEI0340codinggeneM:D2000plusDNALadder;1:BMEI0340基因2.4.2pET32a-BMEI0340表达载体的构建将扩增后的分泌蛋白BMEI0340pcr产物胶回收，使用限制性内切酶BamHI、HindIII，将BMEI0340片段与pET32a表达载体同时酶切、回收、连接、转化DH5α感受态细胞，重组载体鉴定引物PCR鉴定阳性菌株，将鉴定为阳性的菌株扩大培养提取质粒，使用BamHI、HindIII限制性内切酶对重组质粒进行
【参考文献】：
期刊论文
[1]IL-1β、TNF-α联合IL-6对胃癌的诊断价值[J]. 董志强,刘美荣,任秀梅. 实用癌症杂志. 2020(01)
[2]布鲁氏菌病合并脊柱炎和关节炎的疼痛分值与血清中细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-4和IL-2的变化特点[J]. 庞盼,张甜,关建萍,张峰波,扈会整,彭巧君. 中国免疫学杂志. 2019(15)
[3]布鲁氏菌病的流行特征及动物疫苗的研究进展[J]. 冯学明,冉多良. 中兽医学杂志. 2019(05)
[4]布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统蛋白BMEI0742基因的原核表达及功能分析[J]. 豆晓霞,刘洋,李敏,荆明龙,李明奇,王小凤,陈创夫,张辉. 江苏农业科学. 2018(12)
[5]布鲁氏菌病的研究进展[J]. 张海霞,孙晓梅,魏凯,刘娜,王玉建,徐煜琳,朱琳. 山东农业大学学报(自然科学版). 2018(03)
[6]牛种布鲁氏菌病疫苗的研究进展[J]. 高玉环,王慧军,赵鲁,李正道. 畜牧兽医科技信息. 2017(08)
[7]布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统蛋白基因VceA的原核表达、纯化及功能分析[J]. 史静雪,刘来珍,李敏,荆明龙,刘洋,张豫,刘航,张辉. 石河子大学学报(自然科学版). 2017(01)
[8]布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白BMEI1135基因缺失株的构建及鉴定[J]. 江雅丽,王震,陈创夫,李爽,李志强,张辉,郭飞. 石河子大学学报(自然科学版). 2016(05)
[9]布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统蛋白BMEI0339基因的原核表达及免疫反应性分析[J]. 刘来珍,孙志华,刘娟,史静雪,陈创夫,张辉. 石河子大学学报(自然科学版). 2015(06)
[10]布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白BspB的原核表达及布鲁氏菌免疫逃逸分析[J]. 李默,易德武,王远志,陈创夫,于潞,张俊波,郭飞. 中国病原生物学杂志. 2015(09)
博士论文
[1]布鲁氏菌外膜蛋白Omp25对巨噬细胞产生TNF-α的调控作用及机制研究[D]. 罗小毛.西北农林科技大学 2018
[2]布鲁氏菌分泌蛋白的筛选及功能鉴定[D]. 吴同垒.中国农业大学 2015
本文编号：3052534
【文章来源】：河北科技师范学院河北省
【文章页数】：69 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
BMEI0340序列分析
第二章确定分泌蛋白BMEI0340对炎性因子的调节进而鉴定其关键功能区292.3分泌蛋白BMEI0340截短表达为确定该蛋白影响细胞因子表达的关键功能区，将BMEI0340蛋白进行截短表达，截短表达方案如下。图2-1BMEI0340蛋白截短表达方案Fig.2-1truncatedexpressionofBMEI0340protein根据截短方案的要求，利用引物设计软件设计引物，向赛百胜公司提交订单合成引物。将尾部截短40个氨基酸后表达的蛋白命名为24蛋白，头部截短46个氨基酸后表达的蛋白命名为70蛋白。用于扩增24蛋白、70蛋白编码的基因引物见表2-6。表2-624、70蛋白引物信息Table2-624,70Proteinprimerinformation将24蛋白、70蛋白编码的基因构建到克隆载体pET32上，然后通过PCR、双酶切验证其成功表达后，分别提取24蛋白、70蛋白阳性质粒转化到TransB(DE3)感受态细胞中，利用原核表达系统诱导表达蛋白，经SDS-PAGE引物名称引物序列酶切位点扩增片段长24-FATGGATCCGGCTGTGCGTCAAAGAAGAACBamHI318bp24-RAAAAGCTTCGGCACACCGCGCGAAGCGAGGAAGTHindIII70-FAAGGATCCATCCGCGCCGATGCGCAGCAGACGCTBamHI300bp70-RAAAAGCTTTTACCGTCCGGCCCCGTTGAHindIII
第二章确定分泌蛋白BMEI0340对炎性因子的调节进而鉴定其关键功能区30和Westernblot分析24蛋白、70蛋白是否成功表达。确认表达后大量诱导表达，超声裂解菌体，分离上清、沉淀SDS-PAGE电泳确定其表达形式，并利用合适的纯化方式对蛋白进行纯化，除去干扰物质和细菌，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定24、70蛋白的浓度，分装于PCR小管中放于-20℃备用，将24蛋白、70蛋白梯度稀释，同时设置阴性、阳性对照作用细胞，测定其炎性因子表达水平，通过分析数据确定其影响细胞因子表达的关键区段，具体操作同2.2.1-2.2.5。2.4结果2.4.1分泌蛋白BMEI0340编码基因的扩增以灭活的布鲁氏菌核酸为模板,利用表2-1中引物0340-F,0340-R成功扩增出该蛋白的编码基因，与预期大小一致，条带单一，扩增良好，如图2-2。图2-2PCR扩增分泌蛋白BMEI0340编码基因Fig.2-2PCRamplificationofsecretoryproteinBMEI0340codinggeneM:D2000plusDNALadder;1:BMEI0340基因2.4.2pET32a-BMEI0340表达载体的构建将扩增后的分泌蛋白BMEI0340pcr产物胶回收，使用限制性内切酶BamHI、HindIII，将BMEI0340片段与pET32a表达载体同时酶切、回收、连接、转化DH5α感受态细胞，重组载体鉴定引物PCR鉴定阳性菌株，将鉴定为阳性的菌株扩大培养提取质粒，使用BamHI、HindIII限制性内切酶对重组质粒进行
【参考文献】：
期刊论文
[1]IL-1β、TNF-α联合IL-6对胃癌的诊断价值[J]. 董志强,刘美荣,任秀梅. 实用癌症杂志. 2020(01)
[2]布鲁氏菌病合并脊柱炎和关节炎的疼痛分值与血清中细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-4和IL-2的变化特点[J]. 庞盼,张甜,关建萍,张峰波,扈会整,彭巧君. 中国免疫学杂志. 2019(15)
[3]布鲁氏菌病的流行特征及动物疫苗的研究进展[J]. 冯学明,冉多良. 中兽医学杂志. 2019(05)
[4]布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统蛋白BMEI0742基因的原核表达及功能分析[J]. 豆晓霞,刘洋,李敏,荆明龙,李明奇,王小凤,陈创夫,张辉. 江苏农业科学. 2018(12)
[5]布鲁氏菌病的研究进展[J]. 张海霞,孙晓梅,魏凯,刘娜,王玉建,徐煜琳,朱琳. 山东农业大学学报(自然科学版). 2018(03)
[6]牛种布鲁氏菌病疫苗的研究进展[J]. 高玉环,王慧军,赵鲁,李正道. 畜牧兽医科技信息. 2017(08)
[7]布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统蛋白基因VceA的原核表达、纯化及功能分析[J]. 史静雪,刘来珍,李敏,荆明龙,刘洋,张豫,刘航,张辉. 石河子大学学报(自然科学版). 2017(01)
[8]布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白BMEI1135基因缺失株的构建及鉴定[J]. 江雅丽,王震,陈创夫,李爽,李志强,张辉,郭飞. 石河子大学学报(自然科学版). 2016(05)
[9]布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统蛋白BMEI0339基因的原核表达及免疫反应性分析[J]. 刘来珍,孙志华,刘娟,史静雪,陈创夫,张辉. 石河子大学学报(自然科学版). 2015(06)
[10]布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白BspB的原核表达及布鲁氏菌免疫逃逸分析[J]. 李默,易德武,王远志,陈创夫,于潞,张俊波,郭飞. 中国病原生物学杂志. 2015(09)
博士论文
[1]布鲁氏菌外膜蛋白Omp25对巨噬细胞产生TNF-α的调控作用及机制研究[D]. 罗小毛.西北农林科技大学 2018
[2]布鲁氏菌分泌蛋白的筛选及功能鉴定[D]. 吴同垒.中国农业大学 2015
本文编号：3052534
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