DENN结构域蛋白FAM46A调控囊泡运输的作用机制

发布时间：2021-03-01 10:23

　　DENN（Differentially Expressed in Normal cells and Neoplasia）结构域是进化上非常古老且高度保守的蛋白模块,其本身具有鸟苷酸交换因子（guanine nucleotide exchange factors,GEF）活性。研究表明,具有DENN结构域的蛋白常常作为Rab蛋白的GEF发挥作用,负责介导特定的Rab蛋白与GTP结合,使其变为激活构像,从而参与下游反应。Rab是已知最大的单体GTPase家族,通过效应蛋白调控细胞囊泡运输和细胞器稳态等多种功能。FAM45A是一种非经典型DENN家族蛋白,存在于阿米巴、海胆、多种昆虫和脊椎动物等多种真核生物体内且高度保守。我们前期研究表明,FAM45A是晚胞内体/多囊泡体的调节因子,调节晚胞内体的定位、成熟与分泌,但具体作用机制仍不明确。在本研究中,我们构建了多种Rab蛋白的GTP/GDP锁定突变体,利用免疫共沉淀和囊泡稳态功能学回补实验,发现FAM45A与多种Rab有相互作用,其敲降表型可被Rab27a/b的GTP锁定突变体回补,说明FAM45A处于Rab27a/b的上游。其次,我们通过联... 

【文章来源】：苏州大学江苏省

【文章页数】：76 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图１．胞内体／溶酶体系统【１４］??ＩＬＶｓ，ＩＬＶｓ

ＤＥＮＮ结构域蛋白ＦＡＭ４５Ａ调控囊泡运输的作用机制?引言??的货物，并引导货物的再循环。也有研究指出，ＰＩ（３）Ｐ的积累会导致ＷＡＳＨ复合??物被过量招募到胞内体膜上，这对细胞正常的生命活动是不利的。而ＣＣＣ复合物??可以通过募集ＭＴＭＲ２（脂质磷酸酶）来调节胞内体膜上ＰＩ（３）Ｐ水平，进而调节??ＷＡＳＨ复合物的招募［｜｜］。??Ｅｎｄｏｓｏｍｅ?餐?Ｉ??ｌｕｍｅｎ?〇?■??Ａｃｔｉｎ?ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ?（?ＦＡＭ２１?）??ｙ??图２．?ＣＣＣ复合物调节ＰＩ（３）Ｐ水平的机制糢拟图［ｎ】??综上所述，ＣＣＣ复合物自身可能作为一个连接桥梁，募集不同下游蛋白参与??调控多种货物的再循环，也作为ＷＡＳＨ复合物募集水平的负调控因子。有意思的??是其组成成分中含有ＣＯＭＭ结构域的蛋白质本身能二聚化，形成多种组合，很可??能可以识別不同的下游调节因子与货物，但具体不同ＣＣＣ复合物如何调控不同的??囊泡运输的机制还不共了解。弄清ＦＡＭ４５Ａ与ＣＣＣ复合物的关系很可能对理解??ＣＣＣ复合物特异性调节囊泡运输的机制有枳极作用。??７??

反应完成后在反应的ＰＣＲ??管中直接加入Ｒａｂ７ａＸｈｏＩ＿Ｆ，?Ｒａｂ７ａＢａｍＨＩ＿Ｒ引物对，退火温度６１°Ｃ，?ＰＣＲ主反??应循环数设为３３。将ＰＣＲ产物，进行ＤＮＡ电泳，切胶回收正确条带，按前面的??方法进行双酶切、连接、转化、筛选挑斑、测序步骤，得到由Ｃｉｔｒｉｎｅ标记的Ｒａｂ７??（Ｑ６７Ｌ）表达载体。??Ｐ?，?Ｆｍ???＊??■啪?？???＂亡??：?????ＩＩＩ?ｐ?片段?Ｔ?＆?片段?ＴＴ??……ＬＬＣｒｒｉ???图３．重叠延伸ＰＣＲ原理图??重叠延伸ＰＣＲ引物：??Ｒａｂ７ａＸｈｏＩ?＿Ｆ?｜?５，－ＣＣＧＣＣＴＣＧＡＧＧＡＡＴＧＡＣＣＴＣＴＡＧＧＡＡＧＡＡＡＧ－???３；???Ｒａｂ７ａＢａｍＨＩ?＿Ｒ?５，－ＣＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＴＣＡＧＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣＴＴＴ????ｃ－ｒ???１９??


本文编号：3057346