响应面法优化嗜热链球菌AR333电转化条件
发布时间：2021-03-04 05:02
【背景】嗜热链球菌AR333是本实验室从发酵乳中筛选出的一株高产活性胞外多糖乳酸菌。【目的】建立嗜热链球菌AR333高效电转化体系。【方法】通过单因素试验和Box-Behnken响应面法优化电转化条件。【结果】嗜热链球菌AR333最优电转化条件为甘氨酸浓度8.3g/L,OD600为0.8,10%甘油（体积比）和0.5 mol/L蔗糖的电转缓冲液,pIB184质粒80 ng,电场强度14 kV/cm,0.4 mol/L山梨醇、2 mmol/L CaCl2和20 mmol/L MgCl2的LM17复苏培养基,复苏时间5 h。【结论】在最优电转化条件下,嗜热链球菌AR333电转化效率达到3.68×105 CFU/μg-DNA,比优化前提高了14倍,实现了嗜热链球菌AR333的高效遗传转化,为其功能解析和基因工程改造奠定基础。
【文章来源】：微生物学通报. 2020,47(05)北大核心
【文章页数】：9 页
【部分图文】：
各因素交互作用对嗜热链球菌AR333电转化效率的影响
关于乳酸菌电转化效率优化已有较多报道，但关于嗜热链球菌的研究较少。由于菌株之间的差异，采用已有的电转化方法对嗜热链球菌AR333进行转化的效果不理想。因此，本研究首先通过单因素试验对嗜热链球菌AR333的电转化条件进行优化，发现其培养至对数生长中期(OD600为0.8)时电转化效率最高，研究表明该时期细胞生长最旺盛、活力最高，对电击造成的损伤修复能力强，且细胞壁结构相对疏松，有利于电击时孔洞的形成，从而使转化效率较高[15]。洛雪等[10]培养嗜热链球菌sp1.1至OD600为0.8时电转化效率最高，与本研究结果一致。由于嗜热链球菌AR333是革兰氏阳性菌，细胞壁较厚，因此需在生长培养基中添加适当的化学物质来弱化其细胞壁合成，促使形成松散的细胞壁结构，有利于外源DNA导入。甘氨酸是乳酸菌中最常用的细胞壁弱化剂[16-18]，在本研究中甘氨酸浓度为9 g/L时转化效率最大。任婧等[18]在干酪乳杆菌LC2W中考察甘氨酸浓度对转化效率的影响，甘氨酸浓度与本研究结果相近。在其他电转化条件相同的情况下，电转化效率会受到外源质粒浓度的影响[19]。本研究中转化效率随着质粒浓度的增加先升高后降低，原因可能是质粒浓度较低时，细胞未得到充分利用导致转化效率偏低；而质粒浓度较高时，细胞能吸收的质粒过饱和，反而不利于转化[20]。
电转化是嗜热链球菌最有效的转化方法，但电转化效率受细胞生长状态、甘氨酸浓度、质粒浓度、电转缓冲液、复苏培养基、复苏时间和电场强度等因素的影响。通过对不同影响因素进行优化分析，结果表明不同生长状态的嗜热链球菌AR333转化效率存在明显差异。在细胞生长初期，转化效率随着OD600的增大而逐步升高。在初始条件OD600为0.4时，电转化效率为2.64×104 CFU/μg-DNA；当培养细胞至OD600为0.8时，转化效率达到峰值，为8.3×104 CFU/μg-DNA；随着细胞进一步生长，转化效率呈下降趋势(图1A)。嗜热链球菌AR333生长速度与甘氨酸浓度呈负相关，随着甘氨酸浓度升高，细胞生长速率逐步降低；当甘氨酸浓度为15 g/L时，其生长受到明显抑制(图1B)，因此该浓度不适合嗜热链球菌AR333感受态的制备。嗜热链球菌AR333转化效率随甘氨酸浓度增加先上升后下降，当甘氨酸浓度为9 g/L时，转化效率最大，达到8.6×104 CFU/μg-DNA(图1C)，与对照相比提高了18.6倍，说明添加适当浓度甘氨酸有利于电转化效率提高。加入不同浓度质粒的嗜热链球菌AR333感受态细胞转化效率存在明显差异，转化效率随添加质粒浓度的增加先升高后降低，质粒浓度增加到80 ng时，转化效率达到峰值1.15×105 CFU/μg-DNA(图1D)。电转缓冲液中加入蔗糖或山梨醇等渗透保护剂时，嗜热链球菌AR333转化效率大幅度提高，说明加入渗透保护剂有助于增加其转化效率。利用蔗糖作为保护剂的电转缓冲液Ⅱ获得了最高转化效率2.47×105 CFU/μg-DNA(图1E)；电击后加入0.4 mol/L山梨醇、2 mmol/L CaCl2和20 mmol/L MgCl2的复苏培养基Ⅱ，获得了最高转化效率(图1F)；在一定范围内，复苏时间越长，转化效率越高，复苏5 h时转化效率达到最大2.58×105 CFU/μg-DNA，当复苏超过5 h时，转化效率逐步下降(图1G)。在低电场强度条件下，嗜热链球菌AR333转化效率随电场强度的增加而提高，当电场强度达到12.5 kV/cm时，转化效率最高，为3.43×105 CFU/μg-DNA，但进一步增加电场强度时，转化效率有所下降(图1H)。
【参考文献】：
期刊论文
[1]嗜热链球菌胞外多糖生物合成的研究进展[J]. 孔令慧,赵林森,夏永军,张汇,艾连中,熊智强. 食品安全质量检测学报. 2019(02)
[2]利用响应面法优化发酵乳杆菌AR497电转化条件[J]. 韦云莹,赵燕,庄金伟,李江,帕米拉·乃则木丁,陆祎晟,艾连中,熊智强. 食品与发酵工业. 2019(07)
[3]嗜热链球菌的电转化条件[J]. 洛雪,时旭,史海粟,杜阿楠,陈茜,乌日娜,武俊瑞. 食品与发酵工业. 2019(06)
[4]响应面法优化乳酸乳球菌电转化效率研究[J]. 韦云莹,王立峰,熊智强,王世杰,赵林森,艾连中. 上海理工大学学报. 2018(06)
[5]短小芽孢杆菌遗传操作系统的建立及应用[J]. 王超,贺婷婷,宋婷,张长斌,王海燕. 四川大学学报(自然科学版). 2017(05)
[6]保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌相互作用的研究进展[J]. 黄艳娜,游春苹,刘振民. 乳业科学与技术. 2016(06)
[7]高渗提高凝结芽孢杆菌P4-102B菌株的电击转化效率[J]. 赵春云,杨颂,欧阳立明,王永红. 微生物学通报. 2016(06)
[8]植物乳杆菌G63电转化方法的优化[J]. 范璟,席雪冬,黄彦,崔中利. 食品科学. 2016(03)
[9]干酪乳杆菌LC2W最优电转化条件的建立[J]. 任婧,李楠,陈臣,董懿樱,刘振民. 食品安全质量检测学报. 2014(04)
[10]乳酸菌胞外多糖肠道黏附及免疫调节作用研究进展[J]. 李超,王春凤,杨桂连. 食品科学. 2014(11)
硕士论文
[1]人Ⅲ型胶原蛋白肽在嗜热链球菌中的高效表达及发酵优化[D]. 张波.哈尔滨工业大学 2015
[2]质粒pMG36e电转化保加利亚乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和干酪乳杆菌的研究[D]. 杨子萱.河北农业大学 2014
本文编号：3062609
【文章来源】：微生物学通报. 2020,47(05)北大核心
【文章页数】：9 页
【部分图文】：
各因素交互作用对嗜热链球菌AR333电转化效率的影响
关于乳酸菌电转化效率优化已有较多报道，但关于嗜热链球菌的研究较少。由于菌株之间的差异，采用已有的电转化方法对嗜热链球菌AR333进行转化的效果不理想。因此，本研究首先通过单因素试验对嗜热链球菌AR333的电转化条件进行优化，发现其培养至对数生长中期(OD600为0.8)时电转化效率最高，研究表明该时期细胞生长最旺盛、活力最高，对电击造成的损伤修复能力强，且细胞壁结构相对疏松，有利于电击时孔洞的形成，从而使转化效率较高[15]。洛雪等[10]培养嗜热链球菌sp1.1至OD600为0.8时电转化效率最高，与本研究结果一致。由于嗜热链球菌AR333是革兰氏阳性菌，细胞壁较厚，因此需在生长培养基中添加适当的化学物质来弱化其细胞壁合成，促使形成松散的细胞壁结构，有利于外源DNA导入。甘氨酸是乳酸菌中最常用的细胞壁弱化剂[16-18]，在本研究中甘氨酸浓度为9 g/L时转化效率最大。任婧等[18]在干酪乳杆菌LC2W中考察甘氨酸浓度对转化效率的影响，甘氨酸浓度与本研究结果相近。在其他电转化条件相同的情况下，电转化效率会受到外源质粒浓度的影响[19]。本研究中转化效率随着质粒浓度的增加先升高后降低，原因可能是质粒浓度较低时，细胞未得到充分利用导致转化效率偏低；而质粒浓度较高时，细胞能吸收的质粒过饱和，反而不利于转化[20]。
电转化是嗜热链球菌最有效的转化方法，但电转化效率受细胞生长状态、甘氨酸浓度、质粒浓度、电转缓冲液、复苏培养基、复苏时间和电场强度等因素的影响。通过对不同影响因素进行优化分析，结果表明不同生长状态的嗜热链球菌AR333转化效率存在明显差异。在细胞生长初期，转化效率随着OD600的增大而逐步升高。在初始条件OD600为0.4时，电转化效率为2.64×104 CFU/μg-DNA；当培养细胞至OD600为0.8时，转化效率达到峰值，为8.3×104 CFU/μg-DNA；随着细胞进一步生长，转化效率呈下降趋势(图1A)。嗜热链球菌AR333生长速度与甘氨酸浓度呈负相关，随着甘氨酸浓度升高，细胞生长速率逐步降低；当甘氨酸浓度为15 g/L时，其生长受到明显抑制(图1B)，因此该浓度不适合嗜热链球菌AR333感受态的制备。嗜热链球菌AR333转化效率随甘氨酸浓度增加先上升后下降，当甘氨酸浓度为9 g/L时，转化效率最大，达到8.6×104 CFU/μg-DNA(图1C)，与对照相比提高了18.6倍，说明添加适当浓度甘氨酸有利于电转化效率提高。加入不同浓度质粒的嗜热链球菌AR333感受态细胞转化效率存在明显差异，转化效率随添加质粒浓度的增加先升高后降低，质粒浓度增加到80 ng时，转化效率达到峰值1.15×105 CFU/μg-DNA(图1D)。电转缓冲液中加入蔗糖或山梨醇等渗透保护剂时，嗜热链球菌AR333转化效率大幅度提高，说明加入渗透保护剂有助于增加其转化效率。利用蔗糖作为保护剂的电转缓冲液Ⅱ获得了最高转化效率2.47×105 CFU/μg-DNA(图1E)；电击后加入0.4 mol/L山梨醇、2 mmol/L CaCl2和20 mmol/L MgCl2的复苏培养基Ⅱ，获得了最高转化效率(图1F)；在一定范围内，复苏时间越长，转化效率越高，复苏5 h时转化效率达到最大2.58×105 CFU/μg-DNA，当复苏超过5 h时，转化效率逐步下降(图1G)。在低电场强度条件下，嗜热链球菌AR333转化效率随电场强度的增加而提高，当电场强度达到12.5 kV/cm时，转化效率最高，为3.43×105 CFU/μg-DNA，但进一步增加电场强度时，转化效率有所下降(图1H)。
【参考文献】：
期刊论文
[1]嗜热链球菌胞外多糖生物合成的研究进展[J]. 孔令慧,赵林森,夏永军,张汇,艾连中,熊智强. 食品安全质量检测学报. 2019(02)
[2]利用响应面法优化发酵乳杆菌AR497电转化条件[J]. 韦云莹,赵燕,庄金伟,李江,帕米拉·乃则木丁,陆祎晟,艾连中,熊智强. 食品与发酵工业. 2019(07)
[3]嗜热链球菌的电转化条件[J]. 洛雪,时旭,史海粟,杜阿楠,陈茜,乌日娜,武俊瑞. 食品与发酵工业. 2019(06)
[4]响应面法优化乳酸乳球菌电转化效率研究[J]. 韦云莹,王立峰,熊智强,王世杰,赵林森,艾连中. 上海理工大学学报. 2018(06)
[5]短小芽孢杆菌遗传操作系统的建立及应用[J]. 王超,贺婷婷,宋婷,张长斌,王海燕. 四川大学学报(自然科学版). 2017(05)
[6]保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌相互作用的研究进展[J]. 黄艳娜,游春苹,刘振民. 乳业科学与技术. 2016(06)
[7]高渗提高凝结芽孢杆菌P4-102B菌株的电击转化效率[J]. 赵春云,杨颂,欧阳立明,王永红. 微生物学通报. 2016(06)
[8]植物乳杆菌G63电转化方法的优化[J]. 范璟,席雪冬,黄彦,崔中利. 食品科学. 2016(03)
[9]干酪乳杆菌LC2W最优电转化条件的建立[J]. 任婧,李楠,陈臣,董懿樱,刘振民. 食品安全质量检测学报. 2014(04)
[10]乳酸菌胞外多糖肠道黏附及免疫调节作用研究进展[J]. 李超,王春凤,杨桂连. 食品科学. 2014(11)
硕士论文
[1]人Ⅲ型胶原蛋白肽在嗜热链球菌中的高效表达及发酵优化[D]. 张波.哈尔滨工业大学 2015
[2]质粒pMG36e电转化保加利亚乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和干酪乳杆菌的研究[D]. 杨子萱.河北农业大学 2014
本文编号：3062609
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3062609.html
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