非编码RNA和人源Roquin-2复合物的结构生物学研究
发布时间：2021-04-01 02:42
非编码RNA在细胞中起到非常重要的调控作用。组成型衰变元件（CDE）是一段高度保守的含有茎环结构的RNA序列,存在于脊椎动物mRNA的3’末端非编码区,而这些mRNA大多数编码与细胞发育、基因转录、炎症和免疫调节相关的蛋白质,比如肿瘤坏死因子α,诱导型T细胞共刺激因子等。筛选发现CTLA4 RNA是一段长为15 nt的非编码RNA分子,其序列与已报道的CDE序列高度相似,而它的高级结构未知。有研究报道Roquin和它的同源物Roquin-2通过结合细胞内mRNA的CDE序列,促进mRNA的降解,进而维持RNA在细胞内的稳态和预防自身免疫性疾病。人源Roquin-2蛋白是一类泛素连接酶（E3）,它的N端主要包含ROQ和HEPN等结构域,其中ROQ结构域负责与RNA的结合。Roquin-2通过结合CDE而调控mRNA的作用机制是否存在普适的规律目前还不清楚。在本研究中,我们在体外分别纯化了CTLA4 RNA和人源Roquin-2蛋白的两个片段（171-325,87-404）,通过EMSA实验确定了CTLA4 RNA和Roquin-2的相互作用。采用X射线晶体学的方法,解析了2.15?CTL...
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
TNF-的CDE序列比对结果
浙江大学硕士学位论文绪论4利用In-lineProbing分别预测小鼠和人类的TNF-α的CDE37序列的二级结构模型(图1.2)，发现其核心序列形成一个含有六个碱基对的stem结构，命名为P2，P2末端形成一个含有三个碱基的loop，命名为L2。进一步的点突变实验发现，破坏P2的碱基配对(图1.2)会抑制CDE降解mRNA的功能活性(Leppeketal.,2013)。1.2Roquin1.2.1背景利用RNA适配体(Aptamer)进行亲和层析实验，将适配体4xS1m的基因序列连接在CDE37基因序列之后并一起转录成RNA，利用4xS1m对链霉亲和素的高结合性将CDE37固定在层析柱子上，用CDE37去富集细胞裂解液中的蛋白分子，结合质谱分析，筛选发现了Roquin蛋白，包括Roquin-1和它的同源物Roquin-2，可以被CDE37-4xS1m强富集(Leppeketal.,2013)。最早发现Roquin基因是在2005年，对小鼠的基因组系统筛选与自身免疫相关的调节因子，分离出一个患有严重自身免疫性疾病的小鼠品系sanroque，该图1.2CDE37的二级结构模型
浙江大学硕士学位论文绪论5品系会破坏诱导型T细胞共刺激因子——卵泡T细胞的一种必需共刺激受体——的阻遏因子，而致病突变就位于Roquin序列中(Vinuesaetal.,2005)。Roquin被认为是一类泛素连接酶(E3)，因为其N端有一个RING-1型结构，而泛素连接酶(E3)家族蛋白都有RING结构域，而且RING结构域与泛素结合酶(E2)有直接的相互作用(Joazeiro&Weissman,2000;Vinuesaetal.,2005)。1.2.2Roquin-2的结构人源Roquin-2的N端包含一个RING结构域、一个ROQ结构域、两个HEPN结构域以及一个CCCH型的锌指结构，其中，ROQ结构域负责结合mRNA的CDE序列(Tan,Zhou,Kiledjian,&Tong,2014)，而其C端则有一段富含脯氨酸的序列和一段Coiled-coil结构(ShunyaSakurai,UmeharuOhto,&ToshiyukiShimizu,2015)。其中ROQ结构域的三维结构如图1.3所示，主要包含7个α-helix结构和2个β-sheet结构(PDB：4ZLC)(ShunyaSakuraietal.,2015)。1.2.2Roquin和RNA的结合规律Roquin通过识别靶mRNA的CDE序列，参与mRNA的降解，在预防自身免疫性疾病和维持RNA在细胞内的稳态上起着至关重要的作用。一方面，Roquin图1.3Roquin-2的ROQ三级结构
本文编号：3112540
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
TNF-的CDE序列比对结果
浙江大学硕士学位论文绪论4利用In-lineProbing分别预测小鼠和人类的TNF-α的CDE37序列的二级结构模型(图1.2)，发现其核心序列形成一个含有六个碱基对的stem结构，命名为P2，P2末端形成一个含有三个碱基的loop，命名为L2。进一步的点突变实验发现，破坏P2的碱基配对(图1.2)会抑制CDE降解mRNA的功能活性(Leppeketal.,2013)。1.2Roquin1.2.1背景利用RNA适配体(Aptamer)进行亲和层析实验，将适配体4xS1m的基因序列连接在CDE37基因序列之后并一起转录成RNA，利用4xS1m对链霉亲和素的高结合性将CDE37固定在层析柱子上，用CDE37去富集细胞裂解液中的蛋白分子，结合质谱分析，筛选发现了Roquin蛋白，包括Roquin-1和它的同源物Roquin-2，可以被CDE37-4xS1m强富集(Leppeketal.,2013)。最早发现Roquin基因是在2005年，对小鼠的基因组系统筛选与自身免疫相关的调节因子，分离出一个患有严重自身免疫性疾病的小鼠品系sanroque，该图1.2CDE37的二级结构模型
浙江大学硕士学位论文绪论5品系会破坏诱导型T细胞共刺激因子——卵泡T细胞的一种必需共刺激受体——的阻遏因子，而致病突变就位于Roquin序列中(Vinuesaetal.,2005)。Roquin被认为是一类泛素连接酶(E3)，因为其N端有一个RING-1型结构，而泛素连接酶(E3)家族蛋白都有RING结构域，而且RING结构域与泛素结合酶(E2)有直接的相互作用(Joazeiro&Weissman,2000;Vinuesaetal.,2005)。1.2.2Roquin-2的结构人源Roquin-2的N端包含一个RING结构域、一个ROQ结构域、两个HEPN结构域以及一个CCCH型的锌指结构，其中，ROQ结构域负责结合mRNA的CDE序列(Tan,Zhou,Kiledjian,&Tong,2014)，而其C端则有一段富含脯氨酸的序列和一段Coiled-coil结构(ShunyaSakurai,UmeharuOhto,&ToshiyukiShimizu,2015)。其中ROQ结构域的三维结构如图1.3所示，主要包含7个α-helix结构和2个β-sheet结构(PDB：4ZLC)(ShunyaSakuraietal.,2015)。1.2.2Roquin和RNA的结合规律Roquin通过识别靶mRNA的CDE序列，参与mRNA的降解，在预防自身免疫性疾病和维持RNA在细胞内的稳态上起着至关重要的作用。一方面，Roquin图1.3Roquin-2的ROQ三级结构
本文编号：3112540
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