毕赤酵母基因编辑技术研究进展
发布时间：2021-04-01 20:24
巴斯德毕赤酵母是一种重要的蛋白表达系统,基因编辑技术作为代谢工程的基本工具,对于毕赤酵母的代谢改造十分重要。近十年基因编辑技术发展迅速,除传统的同源重组和Cre/loxP重组外,相继出现了许多新的基因编辑技术,例如ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9等,这些技术的出现使基因编辑更加简便高效。本文对毕赤酵母中传统和新型基因编辑技术的原理应用和研究进展进行了简要综述,并结合相关领域的发展对毕赤酵母基因编辑技术的发展进行了展望。
【文章来源】：微生物学通报. 2020,47(02)北大核心CSCD
【文章页数】：9 页
【部分图文】：
RNA polⅡ启动子和RNA polⅢ启动子表达的gRNA结构差别[30]
Cre/loxP系统是20世纪80年代末发展起来的一种基因修饰技术，源于P1噬菌体[16]。Cre是一种位点特异性重组酶，是由343个氨基酸组成的一种双结构域蛋白，两个结构域分别是N-端结构域(N-terminal domain,NTD)和C-端结构域(C-terminal domain,CTD)。Cre重组酶能够特异性识别loxP位点，对两个位点间的基因进行重组[17]。loxP位点由两个13 bp的反向重复序列和8 bp的间隔序列组成，间隔序列位于两个反向重复序列中间，决定了loxP位点的方向。两边的两个反向重复序列分别和间隔序列1、8位上的碱基组成两个14 bp的重组酶结合元件(recombinase-binding element,RBE)，一个RBE的突变对酶和位点的结合影响不大，但当两个RBE都发生突变时，Cre重组酶与loxP位点的结合效率将会大大下降[14]。当Cre重组酶的NTD识别到loxP位点时，便会结合到loxP位点的一个RBE上，而后两个结构域将DNA双链包围，形成一个如图2A所示的“C”型的夹子。两个loxP位点一共结合4个Cre重组酶，4个Cre酶会组成一个四聚体，由结构域CTD对DNA序列进行切割，切割位点分别位于两个间隔序列的1/2位和7/8之间[17-18]，如图2B所示。Cre酶介导两个位点间基因的重组方式取决于两个loxP位点的方向，根据不同的情况，一共分为3种重组方式：(1)当两个位点在同一条DNA链上，且方向相同时，Cre重组酶可以对2个位点间的序列进行切除；(2)当两个位点在同一条链上，且方向相反时，Cre重组酶能够将两个位点间的基因方向调换；(3)当两个位点位于不同的两条链上时，Cre重组酶能够介导两条链之间的基因交换。目前在毕赤酵母中使用较多的是基因敲除功能，倒位和易位的功能使用较少。
引导Cas9的RNA由两部分组成，一部分是靶向目标系列的crRNA(CRISPR targeting RNA)，该部分是由前体RNA(pre-crRNA)加工而来的一段含有保守重复序列和间隔序列的RNA，可以通过修改间隔序列靶向不同的DNA序列。另一部分是与重复序列互补的反式激活crRNA,tracrRNA(trans-activating crRNA)。这两部RNA相互结合后与Cas9形成一个复合体，将Cas9引导到靶标序列，在crRNA互补序列下游临近PAM位点区对DNA进行剪切，产生DSB，从而激发HR或NHEJ。为方便使用，Jinek等将两部分进行简化，形成了由一个结构RNA和20 bp靶向目标基因的可变RNA组成的single-guide RNA(gRNA或sgRNA)[28]，从而使该系统使用更简便。CRISPR/Cas9系统虽然操作简便，但是Cas9蛋白序列和gRNA序列的选择和表达等多种因素都会影响编辑效率。对于不同的物种，我们需要选择不同的条件来达到较高的效率。Cas的表达主要涉及到启动子的强弱，序列密码子的优化。在酿酒酵母中的研究发现，使用强启动子表达Cas9会对菌株的生长造成负面影响，但选择诱导型启动子又会因表达时间不够，导致编辑效率下降至20%以下，而选用组成型的弱启动子不仅不会影响菌株生长还能保证较高的编辑效率[29]。除启动子外，Cas9蛋白序列的选择也是影响编辑效率的重要因素，目前使用较为广泛的Cas9蛋白是来自于化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的SpCas9[27,29]，但Weninger等通过研究发现，SpCas9和PpCas9(由SpCas9经过毕赤酵母表达密码子优化得到)在毕赤酵母中的编辑效率都很低，而经过人源密码子优化的HsCas9在毕赤酵母中能发挥较好的作用[30]。
本文编号：3113917
【文章来源】：微生物学通报. 2020,47(02)北大核心CSCD
【文章页数】：9 页
【部分图文】：
RNA polⅡ启动子和RNA polⅢ启动子表达的gRNA结构差别[30]
Cre/loxP系统是20世纪80年代末发展起来的一种基因修饰技术，源于P1噬菌体[16]。Cre是一种位点特异性重组酶，是由343个氨基酸组成的一种双结构域蛋白，两个结构域分别是N-端结构域(N-terminal domain,NTD)和C-端结构域(C-terminal domain,CTD)。Cre重组酶能够特异性识别loxP位点，对两个位点间的基因进行重组[17]。loxP位点由两个13 bp的反向重复序列和8 bp的间隔序列组成，间隔序列位于两个反向重复序列中间，决定了loxP位点的方向。两边的两个反向重复序列分别和间隔序列1、8位上的碱基组成两个14 bp的重组酶结合元件(recombinase-binding element,RBE)，一个RBE的突变对酶和位点的结合影响不大，但当两个RBE都发生突变时，Cre重组酶与loxP位点的结合效率将会大大下降[14]。当Cre重组酶的NTD识别到loxP位点时，便会结合到loxP位点的一个RBE上，而后两个结构域将DNA双链包围，形成一个如图2A所示的“C”型的夹子。两个loxP位点一共结合4个Cre重组酶，4个Cre酶会组成一个四聚体，由结构域CTD对DNA序列进行切割，切割位点分别位于两个间隔序列的1/2位和7/8之间[17-18]，如图2B所示。Cre酶介导两个位点间基因的重组方式取决于两个loxP位点的方向，根据不同的情况，一共分为3种重组方式：(1)当两个位点在同一条DNA链上，且方向相同时，Cre重组酶可以对2个位点间的序列进行切除；(2)当两个位点在同一条链上，且方向相反时，Cre重组酶能够将两个位点间的基因方向调换；(3)当两个位点位于不同的两条链上时，Cre重组酶能够介导两条链之间的基因交换。目前在毕赤酵母中使用较多的是基因敲除功能，倒位和易位的功能使用较少。
引导Cas9的RNA由两部分组成，一部分是靶向目标系列的crRNA(CRISPR targeting RNA)，该部分是由前体RNA(pre-crRNA)加工而来的一段含有保守重复序列和间隔序列的RNA，可以通过修改间隔序列靶向不同的DNA序列。另一部分是与重复序列互补的反式激活crRNA,tracrRNA(trans-activating crRNA)。这两部RNA相互结合后与Cas9形成一个复合体，将Cas9引导到靶标序列，在crRNA互补序列下游临近PAM位点区对DNA进行剪切，产生DSB，从而激发HR或NHEJ。为方便使用，Jinek等将两部分进行简化，形成了由一个结构RNA和20 bp靶向目标基因的可变RNA组成的single-guide RNA(gRNA或sgRNA)[28]，从而使该系统使用更简便。CRISPR/Cas9系统虽然操作简便，但是Cas9蛋白序列和gRNA序列的选择和表达等多种因素都会影响编辑效率。对于不同的物种，我们需要选择不同的条件来达到较高的效率。Cas的表达主要涉及到启动子的强弱，序列密码子的优化。在酿酒酵母中的研究发现，使用强启动子表达Cas9会对菌株的生长造成负面影响，但选择诱导型启动子又会因表达时间不够，导致编辑效率下降至20%以下，而选用组成型的弱启动子不仅不会影响菌株生长还能保证较高的编辑效率[29]。除启动子外，Cas9蛋白序列的选择也是影响编辑效率的重要因素，目前使用较为广泛的Cas9蛋白是来自于化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的SpCas9[27,29]，但Weninger等通过研究发现，SpCas9和PpCas9(由SpCas9经过毕赤酵母表达密码子优化得到)在毕赤酵母中的编辑效率都很低，而经过人源密码子优化的HsCas9在毕赤酵母中能发挥较好的作用[30]。
本文编号：3113917
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3113917.html
教材专著
