Elabela对人脐带华通胶间充质干细胞定向心肌样细胞分化效率影响的实验研究
发布时间：2021-04-08 02:36
研究目的研究Elabela对人脐带华通胶间充质干细胞（WJ-MSCs）定向心肌样细胞分化的影响以及对APJ表达量的影响。研究方法复苏冻存的人脐带来源的WJ-MSCs,当细胞汇合度达到90%以上时,对细胞进行传代培养。将传代后的细胞置于细胞标准孔板上培养,待汇合度达到80%以上时,添加特定浓度的5氮孢苷（5-aza）培养基诱导24h,将诱导分化的细胞随机分为实验组与对照组,实验组更换为含Elabela的10%胎牛血清DMEM低糖培养基继续培养,对照组更换为含10%胎牛血清DMEM低糖培养基继续培养。分别于诱导第7,14,21和28d,观察、记录细胞形态变化以及生长情况,并收集两组各阶段细胞总RNA和总蛋白,利用实时荧光定量PCR和Western blot技术检测心肌特异性标记物Connexin 43、c Tn T、Nkx2.5 m RNA及蛋白表达;培养至28d时,利用细胞免疫荧光染色技术检测分化后的心肌细胞特异性转录因子Nkx2.5的表达情况;同时用实时荧光定量PCR技术检测两组细胞目的基因APJ表达量,应用流式细胞检测技术检测第28d两组细胞APJ的表达情况。研究结果在人脐带WJ-M...
【文章来源】：安徽医科大学安徽省
【文章页数】：56 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
倒置显微镜下记录人脐带WJ-MSCs细胞形态（×40）
安徽医科大学硕士学位论文205.2Elabela对定向心肌样细胞分化细胞形态的影响第3d可见孔板中细胞汇合度达到80%以上，使用5-aza诱导后，向实验组和对照组加入对应的培养基，分别于第7d，第14d，第21d和第28d观察可见诱导分化后的细胞类似心肌细胞，具有肌管样结构，相较于对照组，实验组细胞增殖速度快，生长密度大，细胞数量多（见图2）。但是，在诱导分化第28d左右，两组均没有观察到自主搏动的细胞。图2倒置显微镜下观察人脐带WJ-MSCs分化为心肌样细胞形态（×40）Fig2ObservingthedifferentiationofhumanumbilicalcordWJ-MSCsintocardiomyocyte-likecellsundertheinvertedmicroscope(×40)5.3Westernblot检测Elabela对细胞各心肌特异性标记物蛋白表达的影响Westernblot实验结果显示，未分化的人脐带WJ-MSCs不表达Connexin43，少量表达cTnT和Nkx2.5。实验组Connexin43蛋白量的表达，呈现出先增加后下降的趋势，且在第14d的表达量最高，第21d开始出现下降的趋势。在第14d和21d的蛋白表达量均较对照组高，分别提高至对照组142%、140%；实验组Nkx2.5蛋白表达量呈现出一个波动的趋势，但在第14d和21d表达量均高于对照组，分别提高至对照组134%和164%；而cTnT蛋白表达量仅在第21d时高于对照组(P<0.05)。（见图3）
安徽医科大学硕士学位论文21图3人脐带WJ-MSCs诱导分化各阶段心肌特异性标记物的蛋白表达(“*”表示P<0.05)Fig3ExpressionofmyocardialspecificproteinmarkersduringvariousstagesofthedifferentiationofhumanumbilicalcordWJ-MSCs5.4诱导各阶段心肌样细胞mRNA检测5.4.1诱导各阶段心肌样细胞提取的RNA电泳检测提取诱导分化后实验组和对照组各阶段心肌样细胞的总RNA，1.5%的TAE琼脂糖凝胶中进行检测，从结果中可以看出，所有样品的RNA提取结果均正常，基本没有基因组污染。（见图4）
【参考文献】：
期刊论文
[1]脐带间充质干细胞治疗心肌梗死的研究进展[J]. 王泽,张宁坤,陈宇. 实用医学杂志. 2017(20)
[2]Apelin13对人胚胎干细胞定向心肌细胞分化效率的影响[J]. 程涛,陈宇,张宁坤,高连如,王泽,张燕. 山东医药. 2017(33)
[3]APJ在hESCs定向心肌分化过程中的表达特征[J]. 童珊珊,陈宇,张宁坤,高连如,程涛,王泽,雷洪涛,李春花. 安徽医科大学学报. 2016(12)
[4]脐带间充质干细胞治疗缺血性心脏病的新进展[J]. 童珊珊,张宁坤,陈宇. 安徽医科大学学报. 2016(02)
[5]Apelin-13对5-Aza诱导脐带间充质干细胞向心肌细胞分化的影响[J]. 徐小红,王力,张宁坤,郑楠,高连如,朱智明. 解放军医学杂志. 2013(10)
本文编号：3124680
【文章来源】：安徽医科大学安徽省
【文章页数】：56 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
倒置显微镜下记录人脐带WJ-MSCs细胞形态（×40）
安徽医科大学硕士学位论文205.2Elabela对定向心肌样细胞分化细胞形态的影响第3d可见孔板中细胞汇合度达到80%以上，使用5-aza诱导后，向实验组和对照组加入对应的培养基，分别于第7d，第14d，第21d和第28d观察可见诱导分化后的细胞类似心肌细胞，具有肌管样结构，相较于对照组，实验组细胞增殖速度快，生长密度大，细胞数量多（见图2）。但是，在诱导分化第28d左右，两组均没有观察到自主搏动的细胞。图2倒置显微镜下观察人脐带WJ-MSCs分化为心肌样细胞形态（×40）Fig2ObservingthedifferentiationofhumanumbilicalcordWJ-MSCsintocardiomyocyte-likecellsundertheinvertedmicroscope(×40)5.3Westernblot检测Elabela对细胞各心肌特异性标记物蛋白表达的影响Westernblot实验结果显示，未分化的人脐带WJ-MSCs不表达Connexin43，少量表达cTnT和Nkx2.5。实验组Connexin43蛋白量的表达，呈现出先增加后下降的趋势，且在第14d的表达量最高，第21d开始出现下降的趋势。在第14d和21d的蛋白表达量均较对照组高，分别提高至对照组142%、140%；实验组Nkx2.5蛋白表达量呈现出一个波动的趋势，但在第14d和21d表达量均高于对照组，分别提高至对照组134%和164%；而cTnT蛋白表达量仅在第21d时高于对照组(P<0.05)。（见图3）
安徽医科大学硕士学位论文21图3人脐带WJ-MSCs诱导分化各阶段心肌特异性标记物的蛋白表达(“*”表示P<0.05)Fig3ExpressionofmyocardialspecificproteinmarkersduringvariousstagesofthedifferentiationofhumanumbilicalcordWJ-MSCs5.4诱导各阶段心肌样细胞mRNA检测5.4.1诱导各阶段心肌样细胞提取的RNA电泳检测提取诱导分化后实验组和对照组各阶段心肌样细胞的总RNA，1.5%的TAE琼脂糖凝胶中进行检测，从结果中可以看出，所有样品的RNA提取结果均正常，基本没有基因组污染。（见图4）
【参考文献】：
期刊论文
[1]脐带间充质干细胞治疗心肌梗死的研究进展[J]. 王泽,张宁坤,陈宇. 实用医学杂志. 2017(20)
[2]Apelin13对人胚胎干细胞定向心肌细胞分化效率的影响[J]. 程涛,陈宇,张宁坤,高连如,王泽,张燕. 山东医药. 2017(33)
[3]APJ在hESCs定向心肌分化过程中的表达特征[J]. 童珊珊,陈宇,张宁坤,高连如,程涛,王泽,雷洪涛,李春花. 安徽医科大学学报. 2016(12)
[4]脐带间充质干细胞治疗缺血性心脏病的新进展[J]. 童珊珊,张宁坤,陈宇. 安徽医科大学学报. 2016(02)
[5]Apelin-13对5-Aza诱导脐带间充质干细胞向心肌细胞分化的影响[J]. 徐小红,王力,张宁坤,郑楠,高连如,朱智明. 解放军医学杂志. 2013(10)
本文编号：3124680
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