PRRSV N蛋白双抗夹心ELISA方法的建立及对Toll样受体介导的信号通路的影响
发布时间：2021-04-09 05:05
猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是近三十年来给全球养猪业造成严重影响的传染性疾病之一,主要以妊娠母猪的繁殖障碍及仔猪出现呼吸系统症状为特征。其病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）,该病毒具有抗原频繁变异性、嗜巨噬细胞性、抗体依赖性增强（antibody dependent enhancement,ADE）及持续感染性等特点,现有的疫苗尚不具备很好的保护力。近年来,国内高致病性PRRSV的流行给养猪业造成巨大的经济损失,虽然目前已有大量对其致病机制的研究,但随着抗原变异和相关受体的不断发现,该病具体的致病机制依旧留有些许空白。N蛋白是由相对保守的PRRSV ORF7编码的核衣壳蛋白（nucleocapsid protein）,在保护病毒RNA及病毒复制、转录和病毒粒子的装配过程中发挥重要作用。早期研究表明N蛋白是PRRSV感染过程中产生最多的结构蛋白,可以在感染早期诱发机体产生大量特异性抗体...
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：73 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
PRRSV的基因组结构和成熟病毒粒子(Sergioetal.2019)
第一章猪繁殖与呼吸综合征研究进展9Marc-145细胞过程中起着非常重要的作用(Huangetal.2013)。Shanmukappa等人认为PRRSV的3’UTR与CD151存在相互作用，这种与RNA结合的能力可能有助于促进病毒复制(Shanmukhappaetal.2007a)。波形蛋白是中间丝(Intermediatefilament，IF)中含量最多的成分，是一种III型IF蛋白，广泛表达于各种细胞中并与微管和微丝共同组成细胞骨架结构。波形蛋白被认为是PRRSV的细胞受体，但目前相关报道较少。Kim等人提出波形蛋白与PRRSV核衣壳蛋白结合时可部分阻断PRRSV感染Marc-145细胞，而当与抗波形蛋白的单克隆抗体结合时可彻底阻断该感染过程(Kimetal.2006)。通过对感染PRRSV的PAMs和Marc-145细胞进行蛋白质组学分析和Westernblot检测，发现波形蛋白在PRRSV感染过程中出现上调(Zhuangetal.2012)。非肌肉肌球蛋白（non-musclemyosinII，NMⅡ）是由一对230ku的重链和两对轻链组成的肌动蛋白的结合蛋白，它通过自身磷酸化调节肌动蛋白的结合过程。哺乳动物的NMⅡ重链有三种同源异构体，依次为MYH9（NMHC-IIA）、MYH10（NMHC-IIB）及MYH14（NMHC-IIC）。通过一种识别PRRSVGP5独特型抗体的单克隆抗独特型抗体(Mab2-5G2)能够识别在真核细胞中广泛表达的MYH9。MYH9的C末端结构域与GP5存在物理相互作用，从而在PRRSV感染过程中发挥重要作用(Gaoetal.2013b;Zhouetal.2008)。总之，了解细胞受体间或者受体与其他分子的相互作用对于研发新的抗病毒疫苗和试剂，以及开发用于疫苗生产和病毒分离的新细胞系都是非常有价值的。然而，目前人们对于PRRSV的细胞受体还知之甚少，所以关于这方面的相关研究仍需要进一步加深。图1-2PRRSV的主要受体模式图(Zhangetal.2015)Figure1-2TheprimaryreceptorofPRRSV(Zhangetal.2015)
第二章PRRSV-N蛋白的诱导表达及双抗夹心ELISA方法的建立23在已确定的最佳反应条件下，将重组表达的PRRSV-N蛋白按梯度依次稀释为0.625g/mL、0.3125g/mL、0.156g/mL作为检测抗原，并设立未加蛋白对照组，根据检测结果可绘制相应标准曲线。2.2.8PRRSV-N双抗夹心ELISA方法检测样品（1）样品制备将Marc-145细胞培养至状态良好时，胰酶消化计数，按1105/mL铺于24孔细胞培养板中，培养24h后加入1MOI的PRRSV-JXA1毒株，分别在感染24h、48h和72h时收集细胞培养上清。将实验室分离冻存的PAMs复苏后，按1106/mL铺于12孔细胞培养板，培养12h加入1MOI的PRRSV-JXA1毒株，分别在感染24h、36h和48h时收集细胞培养上清。（2）检测样品将收集的细胞培养上清作为待检测抗原，利用已建立的双抗夹心ELISA进行检测，每一时间点收集的样品必须立即检测，避免发生冻融。2.3试验结果与分析2.3.1pET28a-N质粒的构建以PRRSV-SD16的感染性克隆为模板，利用特异性引物扩增出PRRSVORF7基因，扩增片段大小与预期结果一致（图2-1）。图2-1pET28a-N重组载体的构建（A）PCR扩增结果基因片段（B）菌液PCR鉴定阳性克隆Figure.2-1ConstructionofpET28a-Nrecombinantvector（A）AmplificationofgenefragmentbyPCR（B）IdentificationofpositiveclonebybacterialfluidPCR将菌液PCR鉴定为阳性的克隆菌扩大培养并提取质粒，利用BamHⅠ和HindⅢ限制性内切酶对重组质粒进行双酶切鉴定（图2-2）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白磷酸化位点鉴定及其作用研究[J]. 刘欢,姜一峰,黄勤锋,杨莘,张文超,虞凌雪,高飞,周艳君,童光志. 中国预防兽医学报. 2017(07)
[2]猪CD151转基因PK-15细胞系构建及其对猪繁殖与呼吸综合征病毒的易感性[J]. 黄燕燕,郭睿,张钰,张鑫宇,夏晓莉,孙怀昌. 微生物学报. 2013(05)
博士论文
[1]高致病性PRRSV双抗夹心ELISA抗原检测试剂盒的研制及基因工程疫苗的研究[D]. 徐凤琴.华中农业大学 2013
本文编号：3126974
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：73 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
PRRSV的基因组结构和成熟病毒粒子(Sergioetal.2019)
第一章猪繁殖与呼吸综合征研究进展9Marc-145细胞过程中起着非常重要的作用(Huangetal.2013)。Shanmukappa等人认为PRRSV的3’UTR与CD151存在相互作用，这种与RNA结合的能力可能有助于促进病毒复制(Shanmukhappaetal.2007a)。波形蛋白是中间丝(Intermediatefilament，IF)中含量最多的成分，是一种III型IF蛋白，广泛表达于各种细胞中并与微管和微丝共同组成细胞骨架结构。波形蛋白被认为是PRRSV的细胞受体，但目前相关报道较少。Kim等人提出波形蛋白与PRRSV核衣壳蛋白结合时可部分阻断PRRSV感染Marc-145细胞，而当与抗波形蛋白的单克隆抗体结合时可彻底阻断该感染过程(Kimetal.2006)。通过对感染PRRSV的PAMs和Marc-145细胞进行蛋白质组学分析和Westernblot检测，发现波形蛋白在PRRSV感染过程中出现上调(Zhuangetal.2012)。非肌肉肌球蛋白（non-musclemyosinII，NMⅡ）是由一对230ku的重链和两对轻链组成的肌动蛋白的结合蛋白，它通过自身磷酸化调节肌动蛋白的结合过程。哺乳动物的NMⅡ重链有三种同源异构体，依次为MYH9（NMHC-IIA）、MYH10（NMHC-IIB）及MYH14（NMHC-IIC）。通过一种识别PRRSVGP5独特型抗体的单克隆抗独特型抗体(Mab2-5G2)能够识别在真核细胞中广泛表达的MYH9。MYH9的C末端结构域与GP5存在物理相互作用，从而在PRRSV感染过程中发挥重要作用(Gaoetal.2013b;Zhouetal.2008)。总之，了解细胞受体间或者受体与其他分子的相互作用对于研发新的抗病毒疫苗和试剂，以及开发用于疫苗生产和病毒分离的新细胞系都是非常有价值的。然而，目前人们对于PRRSV的细胞受体还知之甚少，所以关于这方面的相关研究仍需要进一步加深。图1-2PRRSV的主要受体模式图(Zhangetal.2015)Figure1-2TheprimaryreceptorofPRRSV(Zhangetal.2015)
第二章PRRSV-N蛋白的诱导表达及双抗夹心ELISA方法的建立23在已确定的最佳反应条件下，将重组表达的PRRSV-N蛋白按梯度依次稀释为0.625g/mL、0.3125g/mL、0.156g/mL作为检测抗原，并设立未加蛋白对照组，根据检测结果可绘制相应标准曲线。2.2.8PRRSV-N双抗夹心ELISA方法检测样品（1）样品制备将Marc-145细胞培养至状态良好时，胰酶消化计数，按1105/mL铺于24孔细胞培养板中，培养24h后加入1MOI的PRRSV-JXA1毒株，分别在感染24h、48h和72h时收集细胞培养上清。将实验室分离冻存的PAMs复苏后，按1106/mL铺于12孔细胞培养板，培养12h加入1MOI的PRRSV-JXA1毒株，分别在感染24h、36h和48h时收集细胞培养上清。（2）检测样品将收集的细胞培养上清作为待检测抗原，利用已建立的双抗夹心ELISA进行检测，每一时间点收集的样品必须立即检测，避免发生冻融。2.3试验结果与分析2.3.1pET28a-N质粒的构建以PRRSV-SD16的感染性克隆为模板，利用特异性引物扩增出PRRSVORF7基因，扩增片段大小与预期结果一致（图2-1）。图2-1pET28a-N重组载体的构建（A）PCR扩增结果基因片段（B）菌液PCR鉴定阳性克隆Figure.2-1ConstructionofpET28a-Nrecombinantvector（A）AmplificationofgenefragmentbyPCR（B）IdentificationofpositiveclonebybacterialfluidPCR将菌液PCR鉴定为阳性的克隆菌扩大培养并提取质粒，利用BamHⅠ和HindⅢ限制性内切酶对重组质粒进行双酶切鉴定（图2-2）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白磷酸化位点鉴定及其作用研究[J]. 刘欢,姜一峰,黄勤锋,杨莘,张文超,虞凌雪,高飞,周艳君,童光志. 中国预防兽医学报. 2017(07)
[2]猪CD151转基因PK-15细胞系构建及其对猪繁殖与呼吸综合征病毒的易感性[J]. 黄燕燕,郭睿,张钰,张鑫宇,夏晓莉,孙怀昌. 微生物学报. 2013(05)
博士论文
[1]高致病性PRRSV双抗夹心ELISA抗原检测试剂盒的研制及基因工程疫苗的研究[D]. 徐凤琴.华中农业大学 2013
本文编号：3126974
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3126974.html
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