酵母亚细胞结构分离效率评估菌株的构建

发布时间：2021-04-13 00:38

　　背景:真核细胞依赖其亚细胞结构高效地完成复杂的生化反应。尽管目前有一些亚细胞结构分离技术,但却缺乏评估这些分离技术的简单、有效方法。目的:构建可以用来检测亚细胞结构分离效率的酿酒酵母菌株。方法:通过传统的分子生物学与细胞生物学方法以酿酒酵母为背景构建了亚细胞结构分离效率评估菌株,并进行可行性检测。首先,将酵母各细胞器、自噬体及质膜的标记蛋白进行分组,用不同的蛋白标签分别标记每组蛋白。然后,以标记蛋白-GFP/RFP作为对照组通过免疫荧光法检测蛋白标签对标记蛋白的亚细胞定位是否有影响。最后,通过非连续性密度梯度离心验证该检测菌株能否用来检测亚细胞结构的分离效率。结果:成功构建了酵母亚细胞结构分离效率评估菌株,该菌株标记了大多数酵母细胞亚细胞结构。挂标签的标记蛋白仍然定位在各自标记蛋白对应的亚细胞结构。非连续性密度梯度离心后,酵母各个亚细胞结构的标记蛋白均可以被检测到。结论:该酵母亚细胞结构分离效率评估菌株是检测各亚细胞结构分离结果的方便工具,对今后酿酒酵母细胞生物学的研究有潜在的应用价值。 

【文章来源】：中国生物工程杂志. 2020,40(10)北大核心CSCD

【文章页数】：14 页

【部分图文】：

YOT027 Western blot检测结果图

除了以上这些有特定形态的亚细胞结构外，其他细胞器的标记蛋白同样也被检测。与脂代谢有关的细胞器过氧化物酶体和脂滴，他们挂标签的标记蛋白(Pex3-4myc,Erg6-2flag)分别与它们荧光蛋白标记的蛋白(Pex3-Du Dre,Erg6-m Cherry)共定位(图2f，图2g)。早高尔基体、晚高尔基体及晚内体的免疫荧光结果与上述相同:Anp1/Chs5/Snf7-4v5与Anp1/Chs5/Snf7-m Cherry均共定位(图2h，图2i，图2j)。Atg8是自噬体的标记蛋白[20],GFP-Atg8与9vsv-Atg8共定位且与GFP-Atg8单独的荧光信号一致(图2k)。综上所述，本文中挂标签的各标记蛋白的亚细胞定位没有改变。图2 免疫荧光与荧光蛋白共定位图

免疫荧光与荧光蛋白共定位图


本文编号：3134283