非天然氨基酸正交翻译技术：一种新型基因工程活病毒疫苗研发技术
发布时间：2021-04-15 12:59
非天然氨基酸正交翻译技术利用外源的非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶（aaRS）基因和对应的tRNA基因构建非天然氨基酸正交翻译系统（Orthogonal translation system）。该正交翻译系统能利用终止密码子在蛋白翻译过程中将非天然氨基酸定点插入目标多肽链中。该技术不但是一种新的蛋白质生化研究工具,在新型基因工程病毒疫苗研究中更具有划时代的意义。利用人为构建的具有非天然氨基酸正交翻译系统的转基因细胞,通过在病毒复制的关键基因中引入提前终止密码子构建的突变病毒,在添加非天然氨基酸的情况下该基因仍能完整表达从而完成病毒的复制和传代,但该突变病毒在正常细胞（无非天然氨基酸正交翻译系统的宿主细胞）中因复制关键基因不能完整表达而无法复制传代,因而是一种复制缺陷型病毒。这种复制缺陷型病毒用作疫苗时兼具了减毒活疫苗免疫效果良好与灭活疫苗安全性高的优点,是一种较为理想的活病毒疫苗。文中简要综述了非天然氨基酸正交翻译技术在新型复制缺陷活病毒疫苗研究中的应用及其前景。
【文章来源】：生物工程学报. 2020,36(05)北大核心CSCD
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
利用非天然氨基酸正交翻译技术制备复制缺陷型流感病毒的原理
绝大多数蛋白质是由20种天然蛋白氨基酸构成的，因此我们对蛋白质结构和功能的研究当然会受到这20种氨基酸的限制。而利用非天然氨基酸正交翻译技术在原核生物或真核生物蛋白质中定点引入非天然氨基酸无疑为蛋白质的生物化学研究和蛋白质操纵提供了全新的技术手段。非天然氨基酸正交翻译技术最直接的应用就是利用具有特定生物正交反应性质的非天然氨基酸在活细胞中对蛋白质进行标记，这对目标蛋白功能研究具有巨大的工具意义[16]。如有研究者将合成含有脂肪族叠氮化合物和/或烷基化合物的吡咯赖氨酸类似物定点插入蛋白质后通过“点击”化学修饰高效地进行蛋白标记[17]。将显色基团与插入目标蛋白的UAAs耦合后可用于蛋白质结构和动力学的光谱分析[18]。荧光基团与蛋白质上的UAAs偶联使探针与目标之间的距离最小化，为超分辨率显微镜的观察提供便利[19]。也有研究将光亲和性非天然氨基酸插入目标蛋白作为质谱识别标签，显著提高了对蛋白质相互作用的识别灵敏度[20]。赖氨酸乙酰化是一种蛋白质的翻译后修饰，它和蛋白质磷酸化一样对真核细胞具有重要的调控意义。有研究利用非天然氨基酸正交翻译技术通过大肠杆菌制备了插入Ne-乙酰基赖氨酰酸的重组蛋白，为蛋白质乙酰化的细胞功能研究提供了新的手段[21]。除了在蛋白质基础研究中具有多种应用外，非天然氨基酸正交翻译技术在应用性研究中也展露出巨大的潜力。有研究利用非天然氨基酸正交翻译技术引入UAAs以开发新型蛋白药物(如抗体和激素)，或将插入了非天然氨基酸的抗体通过非天然氨基酸与细胞毒性药物偶联物以靶向癌细胞[22-23]。此外，通过非天然氨基酸正交翻译技术在酶中引入UAAs提高酶活或控制酶活在工业领域和医药领域均具有应用开发潜力[24]。下文将简要综述非天然氨基酸正交翻译技术在新型基因工程活病毒疫苗研究中的应用和前景。
北京大学周德敏课题组在一项研究中构建了几十个在不同基因的不同位置含有提前终止密码子的PTC流感病毒的感染性克隆，然后利用含有MbpylRS/tRNACUA正交对的转基因293T细胞并通过添加非天然氨基酸Ne-2-azidoethyloxycarbonylL-lysine(NAEK)制备了复制缺陷型流感病毒(图3)[35]。研究结果显示构建的绝大部分PTC流感病毒都只能在添加NAEK的转基因细胞中复制，在非转基因细胞或不添加NAEK的转基因细胞中均不能复制，证实了制备的复制缺陷型流感病毒对正常细胞的安全性。该研究进一步对一株含有4个提前终止密码子(PA-R266、PB2-K33、PB1-R52、NP-D101)的复制缺陷型流感病毒PTC-4A作为候选疫苗株进行了深入的研究，同株野生型病毒对小鼠的LD50为8×103 PFU，而小鼠攻毒试验证实用109 PFU的PTC-4A进行攻毒后10只小鼠无一发病或死亡。在105 PFU攻毒剂量下，PTC-4A株与CIAV株(商品化的冷适应弱毒疫苗株)相比无论是体重情况和第3天组织带毒量均明显优于CIAV株，证实了PTC-4A株的安全性优于常规的弱毒疫苗株。在免疫效力方面，小鼠免疫实验证实PTC-4A株与CIAV株相比在HI抗体滴度、NT抗体滴度、IgA抗体滴度和特异性CD8+T细胞反应各方面均无显著差异，但显著优于灭活疫苗。小鼠免疫保护实验证实在两次免疫和50倍LD50攻毒情况下，PTC-4A株与CIAV株免疫小鼠存活率均为100%，而灭活疫苗免疫小鼠的存活率只有70%。图3 利用非天然氨基酸正交翻译技术制备复制缺陷型流感病毒的原理
本文编号：3139385
【文章来源】：生物工程学报. 2020,36(05)北大核心CSCD
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
利用非天然氨基酸正交翻译技术制备复制缺陷型流感病毒的原理
绝大多数蛋白质是由20种天然蛋白氨基酸构成的，因此我们对蛋白质结构和功能的研究当然会受到这20种氨基酸的限制。而利用非天然氨基酸正交翻译技术在原核生物或真核生物蛋白质中定点引入非天然氨基酸无疑为蛋白质的生物化学研究和蛋白质操纵提供了全新的技术手段。非天然氨基酸正交翻译技术最直接的应用就是利用具有特定生物正交反应性质的非天然氨基酸在活细胞中对蛋白质进行标记，这对目标蛋白功能研究具有巨大的工具意义[16]。如有研究者将合成含有脂肪族叠氮化合物和/或烷基化合物的吡咯赖氨酸类似物定点插入蛋白质后通过“点击”化学修饰高效地进行蛋白标记[17]。将显色基团与插入目标蛋白的UAAs耦合后可用于蛋白质结构和动力学的光谱分析[18]。荧光基团与蛋白质上的UAAs偶联使探针与目标之间的距离最小化，为超分辨率显微镜的观察提供便利[19]。也有研究将光亲和性非天然氨基酸插入目标蛋白作为质谱识别标签，显著提高了对蛋白质相互作用的识别灵敏度[20]。赖氨酸乙酰化是一种蛋白质的翻译后修饰，它和蛋白质磷酸化一样对真核细胞具有重要的调控意义。有研究利用非天然氨基酸正交翻译技术通过大肠杆菌制备了插入Ne-乙酰基赖氨酰酸的重组蛋白，为蛋白质乙酰化的细胞功能研究提供了新的手段[21]。除了在蛋白质基础研究中具有多种应用外，非天然氨基酸正交翻译技术在应用性研究中也展露出巨大的潜力。有研究利用非天然氨基酸正交翻译技术引入UAAs以开发新型蛋白药物(如抗体和激素)，或将插入了非天然氨基酸的抗体通过非天然氨基酸与细胞毒性药物偶联物以靶向癌细胞[22-23]。此外，通过非天然氨基酸正交翻译技术在酶中引入UAAs提高酶活或控制酶活在工业领域和医药领域均具有应用开发潜力[24]。下文将简要综述非天然氨基酸正交翻译技术在新型基因工程活病毒疫苗研究中的应用和前景。
北京大学周德敏课题组在一项研究中构建了几十个在不同基因的不同位置含有提前终止密码子的PTC流感病毒的感染性克隆，然后利用含有MbpylRS/tRNACUA正交对的转基因293T细胞并通过添加非天然氨基酸Ne-2-azidoethyloxycarbonylL-lysine(NAEK)制备了复制缺陷型流感病毒(图3)[35]。研究结果显示构建的绝大部分PTC流感病毒都只能在添加NAEK的转基因细胞中复制，在非转基因细胞或不添加NAEK的转基因细胞中均不能复制，证实了制备的复制缺陷型流感病毒对正常细胞的安全性。该研究进一步对一株含有4个提前终止密码子(PA-R266、PB2-K33、PB1-R52、NP-D101)的复制缺陷型流感病毒PTC-4A作为候选疫苗株进行了深入的研究，同株野生型病毒对小鼠的LD50为8×103 PFU，而小鼠攻毒试验证实用109 PFU的PTC-4A进行攻毒后10只小鼠无一发病或死亡。在105 PFU攻毒剂量下，PTC-4A株与CIAV株(商品化的冷适应弱毒疫苗株)相比无论是体重情况和第3天组织带毒量均明显优于CIAV株，证实了PTC-4A株的安全性优于常规的弱毒疫苗株。在免疫效力方面，小鼠免疫实验证实PTC-4A株与CIAV株相比在HI抗体滴度、NT抗体滴度、IgA抗体滴度和特异性CD8+T细胞反应各方面均无显著差异，但显著优于灭活疫苗。小鼠免疫保护实验证实在两次免疫和50倍LD50攻毒情况下，PTC-4A株与CIAV株免疫小鼠存活率均为100%，而灭活疫苗免疫小鼠的存活率只有70%。图3 利用非天然氨基酸正交翻译技术制备复制缺陷型流感病毒的原理
本文编号：3139385
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