具有双保护系统的加强型大肠杆菌工程菌的构建及其应用研究
发布时间：2021-04-16 20:18
大肠杆菌是基因工程领域中使用最广泛的表达宿主菌之一,在发酵过程中存在杂菌污染和噬菌体侵染的问题,目前仍缺乏有效的解决策略。为解决上述问题,本研究以大肠杆菌为研究对象,旨在构建一株能抗杂菌污染和噬菌体侵染的加强型大肠杆菌工程菌。在大肠杆菌中增加两条新的稀有氮磷源代谢途径（抗杂菌系统）,其表达的甲酰胺酶与亚磷酸脱氢酶能专一性催化甲酰胺和亚磷酸盐分别成为铵根离子和磷酸盐作为大肠杆菌生长的氮源和磷源,以防止杂菌污染。在此基础上引入抗噬菌体系统（CRISPR/Cas9）,赋予大肠杆菌工程菌抵抗噬菌体的能力。构建得到的具有双保护系统的加强型大肠杆菌工程菌将具有非常巨大的应用潜力。本课题组通过对具有自主知识产权的类芽孢杆菌Paenibacillus pasadenensis CS0611的转录组进行分析,发现该菌的基因组中含有甲酰胺酶基因,并利用PCR技术扩增得到了该基因的全长序列;另外,通过菌种筛选得到一株能利用亚磷酸盐的肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae strain OU07,并成功克隆了亚磷酸脱氢酶基因的全长序列。详细地分析了两种酶基因及对应蛋白的序列信息和催化结构,发...
【文章来源】：华南理工大学广东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：153 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
CRISPR结构示意图
CRISPR/Cas9系统的改造
第一章绪论15和噬菌体侵染导致的发酵失败已屡见不鲜，发酵罐或培养基灭菌不彻底、空气过滤系统故障等因素都有可能导致大肠杆菌发酵失败。一旦发酵失败，只能做倒灌处理，不仅造成巨大的经济损失和原料浪费，而且还会污染生态环境。因此，如何从根本上控制杂菌污染和噬菌体侵染是一项具有重要实际意义的挑战性难题。图1-6加强型大肠杆菌的构建原理图Fig.1-6SchematicdiagramoftheconstructionoftherobustEscherichiacoliBL21(DE3)strain本研究以大肠杆菌宿主细胞作为研究对象，旨在构建一株能抗杂菌污染和噬菌体侵染的加强型大肠杆菌工程菌。通过生物信息学分析，我们发现甲酰胺酶能专一性水解甲酰胺成为铵根离子，而酰胺酶的底物特异性比较宽，能水解乙酰胺、丙酰胺、丁酰胺、异丁酰胺等[89]，且在NCBI数据库中发现甲酰胺酶的数量要远远少于酰胺酶的数量，这对构建稀有代谢途径来降低染菌概率是非常有利的。此外，亚磷酸脱氢酶能专一性氧化亚磷酸盐成为磷酸盐，并且目前发现的亚磷酸脱氢酶数量少，只有3829条，且只存在于细菌中。迄今为止，还没有发现能同时分泌甲酰胺酶和亚磷酸脱氢酶的微生物。所以，在大肠杆菌工程菌中增加这两条新的稀有氮源和磷源代谢途径，其表达的甲酰胺酶与亚磷酸脱氢酶能专一性催化小分子甲酰胺和亚磷酸盐成为铵根离子和正价磷酸盐分别作为大肠杆菌生长的氮源和磷源。以这两条稀有代谢途径作为抗杂菌系统，可有效降低杂菌污染的概率。在此基础上引入抗噬菌体系统（CRISPR/Cas9）的质粒，赋予大肠杆菌工程菌抵抗T7噬菌体的能力。经改造的加强型大肠杆菌优势工程菌具有非常巨大的应用潜力，一方面保证工程菌正常生长繁殖并表达质粒上的目标基因，另一方面能在未灭菌培养基和开放式的发酵罐中进行安全发酵生产的同?
【参考文献】：
期刊论文
[1]土壤假单胞菌亚磷酸盐脱氢酶的基因克隆和原核表达及其酶活分析[J]. 袁航,罗著,杨玉梅,刘延娟,高艳秀,刘娴,龚明,邹竹荣. 生物技术通报. 2018(08)
[2]CRISPR/Cas9的应用及脱靶效应研究进展[J]. 郑武,谷峰. 遗传. 2015(10)
[3]现代发酵工程技术在食品领域的应用研究进展[J]. 张冰,董磊. 黑龙江科技信息. 2013(13)
[4]重组大肠杆菌BL21（DE3）-pET28a（+）-bgl诱导表达β-葡聚糖酶的条件优化[J]. 李永仙,郑飞云,李崎,顾国贤. 食品与生物技术学报. 2009(02)
[5]现代发酵工程展望[J]. 李彬. 商洛师范专科学校学报. 2003(04)
[6]Inhibition of HBV targeted ribonuclease enhanced by introduction of linker[J]. Wei-Dong Gong Jun Liu Jin Ding Ya Zhao Ying-Hui Li Cai-Fang Xue Department of Pathogenic Organisms,Fourth Military Medical University,Xi’an 710033,Shaanxi Province,China. World Journal of Gastroenterology. 2003(07)
[7]Asymmetric Synthesis of （-）-1-Trimethylsilyl-ethanol with Immobilized Saccharomyces Cerevisiae Cells in Water/Organic Solvent Diphasic System[J]. 娄文勇,宗敏华,范晓丹. Chinese Journal of Chemical Engineering. 2003(02)
博士论文
[1]醋酸杆菌催化手性醇的不对称合成及其反-Prelog羰基还原酶的酶学特性研究[D]. 陈晓红.华南理工大学 2013
硕士论文
[1]代谢工程改造大肠杆菌高产乙醇酸的研究[D]. 马宁.江南大学 2018
[2]幽门螺旋杆菌甲酰胺酶催化羟胺和酰胺反应机理的理论研究[D]. 杨钦磊.西南大学 2012
[3]Pseudomonas sp. M亚磷酸脱氢酶基因的克隆、表达和酶性质的研究[D]. 杜怡青.浙江大学 2010
[4]γ-内酯的酶法动力学拆分以及α-支链醛的不对称氢转移动态动力学拆分[D]. 吴国峰.苏州大学 2008
本文编号：3142103
【文章来源】：华南理工大学广东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：153 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
CRISPR结构示意图
CRISPR/Cas9系统的改造
第一章绪论15和噬菌体侵染导致的发酵失败已屡见不鲜，发酵罐或培养基灭菌不彻底、空气过滤系统故障等因素都有可能导致大肠杆菌发酵失败。一旦发酵失败，只能做倒灌处理，不仅造成巨大的经济损失和原料浪费，而且还会污染生态环境。因此，如何从根本上控制杂菌污染和噬菌体侵染是一项具有重要实际意义的挑战性难题。图1-6加强型大肠杆菌的构建原理图Fig.1-6SchematicdiagramoftheconstructionoftherobustEscherichiacoliBL21(DE3)strain本研究以大肠杆菌宿主细胞作为研究对象，旨在构建一株能抗杂菌污染和噬菌体侵染的加强型大肠杆菌工程菌。通过生物信息学分析，我们发现甲酰胺酶能专一性水解甲酰胺成为铵根离子，而酰胺酶的底物特异性比较宽，能水解乙酰胺、丙酰胺、丁酰胺、异丁酰胺等[89]，且在NCBI数据库中发现甲酰胺酶的数量要远远少于酰胺酶的数量，这对构建稀有代谢途径来降低染菌概率是非常有利的。此外，亚磷酸脱氢酶能专一性氧化亚磷酸盐成为磷酸盐，并且目前发现的亚磷酸脱氢酶数量少，只有3829条，且只存在于细菌中。迄今为止，还没有发现能同时分泌甲酰胺酶和亚磷酸脱氢酶的微生物。所以，在大肠杆菌工程菌中增加这两条新的稀有氮源和磷源代谢途径，其表达的甲酰胺酶与亚磷酸脱氢酶能专一性催化小分子甲酰胺和亚磷酸盐成为铵根离子和正价磷酸盐分别作为大肠杆菌生长的氮源和磷源。以这两条稀有代谢途径作为抗杂菌系统，可有效降低杂菌污染的概率。在此基础上引入抗噬菌体系统（CRISPR/Cas9）的质粒，赋予大肠杆菌工程菌抵抗T7噬菌体的能力。经改造的加强型大肠杆菌优势工程菌具有非常巨大的应用潜力，一方面保证工程菌正常生长繁殖并表达质粒上的目标基因，另一方面能在未灭菌培养基和开放式的发酵罐中进行安全发酵生产的同?
【参考文献】：
期刊论文
[1]土壤假单胞菌亚磷酸盐脱氢酶的基因克隆和原核表达及其酶活分析[J]. 袁航,罗著,杨玉梅,刘延娟,高艳秀,刘娴,龚明,邹竹荣. 生物技术通报. 2018(08)
[2]CRISPR/Cas9的应用及脱靶效应研究进展[J]. 郑武,谷峰. 遗传. 2015(10)
[3]现代发酵工程技术在食品领域的应用研究进展[J]. 张冰,董磊. 黑龙江科技信息. 2013(13)
[4]重组大肠杆菌BL21（DE3）-pET28a（+）-bgl诱导表达β-葡聚糖酶的条件优化[J]. 李永仙,郑飞云,李崎,顾国贤. 食品与生物技术学报. 2009(02)
[5]现代发酵工程展望[J]. 李彬. 商洛师范专科学校学报. 2003(04)
[6]Inhibition of HBV targeted ribonuclease enhanced by introduction of linker[J]. Wei-Dong Gong Jun Liu Jin Ding Ya Zhao Ying-Hui Li Cai-Fang Xue Department of Pathogenic Organisms,Fourth Military Medical University,Xi’an 710033,Shaanxi Province,China. World Journal of Gastroenterology. 2003(07)
[7]Asymmetric Synthesis of （-）-1-Trimethylsilyl-ethanol with Immobilized Saccharomyces Cerevisiae Cells in Water/Organic Solvent Diphasic System[J]. 娄文勇,宗敏华,范晓丹. Chinese Journal of Chemical Engineering. 2003(02)
博士论文
[1]醋酸杆菌催化手性醇的不对称合成及其反-Prelog羰基还原酶的酶学特性研究[D]. 陈晓红.华南理工大学 2013
硕士论文
[1]代谢工程改造大肠杆菌高产乙醇酸的研究[D]. 马宁.江南大学 2018
[2]幽门螺旋杆菌甲酰胺酶催化羟胺和酰胺反应机理的理论研究[D]. 杨钦磊.西南大学 2012
[3]Pseudomonas sp. M亚磷酸脱氢酶基因的克隆、表达和酶性质的研究[D]. 杜怡青.浙江大学 2010
[4]γ-内酯的酶法动力学拆分以及α-支链醛的不对称氢转移动态动力学拆分[D]. 吴国峰.苏州大学 2008
本文编号：3142103
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3142103.html
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