一个黑曲霉细胞色素P450基因启动子的结构与表征

发布时间：2021-04-17 17:09

　　黑曲霉是工业生产上的重要模式菌株,其启动子活性对其生产效率有重要影响;细胞色素P450是调控菌体能量代谢、细胞生长和各种代谢产物合成的关键酶.通过对细胞色素P450基因启动子区域（PP450）的克隆、结构分析和功能鉴定,为P450基因的表达调节研究和P450启动子的应用提供基础.从黑曲霉基因组克隆出细胞色素P450基因（An11g01980）的上游片段PP450,连接到pGEM-T载体进行测序,用启动子分析网站GPMiner和EMBOSS分析PP450片段的启动子功能元件,结果显示:PP450片段的-864～-106 bp处有一段长为759 bp的CpG区域,含有2个TATA盒、6个CAAT盒、2个GC盒和1个可能的AmyR结合位点.构建含PP450启动子的启动子–报告基因表达载体p PZP-PP450并转化黑曲霉,通过荧光强度检测启动子功能,结果表明该启动子是一个组成型启动子,但添加沃氏氧化物后启动子表达强度明显增强,推测该启动子区域可能含有沃氏氧化物相关的反应元件或增强子. 

【文章来源】：天津科技大学学报. 2020,35(06)

【文章页数】：6 页

【部分图文】：

PP450片段的扩增

将PP450片段连接到p GEM-T载体上构建出p T-PP450并进行测序．测序结果表明，克隆的PP450序列长1 080 bp，与报道的An11g01980基因上游序列完全一致．用启动子分析网站GPMiner和EMBOSS对PP450片段进行结构分析，结果如图2所示，其中阴影部分为预测的启动子元件，TSS为转录起始位点．在翻译起始位点上游43 bp处为可能的转录起始位点(TSS)，在TSS上游有两个可能的TATA盒，它们与TATA盒的保守序列TATAAAA并不完全一致但高度相似；PP450上还有6个可能的CAAT盒，其中2个CAAT盒与其保守序列基本一致，其余4个CAAT盒与其保守序列也高度相似；另外，还有2个GC盒在PP450的负链上；PP450片段的-864～-106 bp处有一段长为759 bp的Cp G区域．特别有趣的是，在PP450上还发现转录因子Amy R的1个可能的结合位点序列CCGTATATGGTCCG，这个序列是否真的能结合转录因子Amy R并参与转录调节，还需要实验证实．PP450启动子元件的具体信息见表1.

将p T-PP450载体与p PZP-Pepo1载体均经HindⅢ、AvrⅡ双酶切和连接后构建成所需要的目的载体p PZP-PP450，转化大肠杆菌JM109感受态细胞后，经Kana抗性筛选，挑取阳性转化子提质粒并用HindⅢ和SpeⅠ进行双酶切验证，结果如图3所示．条带与理论大小(10 000 bp和3 000 bp)一致，说明目的载体p PZP-PP450构建成功．2.3 黑曲霉的转化和验证

【参考文献】：
期刊论文
[1]一种用于PCR扩增的丝状真菌DNA快速提取方法[J]. 潘力,崔翠,王斌.  微生物学通报. 2010(03)

博士论文
[1]白腐真菌细胞色素P450转化难降解有机物的功能研究[D]. 宁大亮.清华大学 2009

硕士论文
[1]少孢节丛孢菌Aoz1基因及其启动子的研究[D]. 王新芳.内蒙古农业大学 2018
[2]玉米黑粉菌cyp51基因上游启动子克隆及功能鉴定[D]. 黎晨.华中师范大学 2010



本文编号：3143822