应用CRISPR/Cas9技术构建人PTPN12基因敲除的A549稳定细胞株

发布时间：2021-04-19 13:33

　　PTPN12（Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 12）是编码人源PEST蛋白的基因,位于人常染色体7q11.23,在造血系统的相关细胞中高度表达,且主要表达在细胞质中。它由N端的催化结构域和C端的调节结构域组成,N端具有酪氨酸磷酸酶家族的高度保守特定基序,而亲水C端富含脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸和苏氨酸,调节PEST与底物蛋白的相互作用。有研究表明,PTP-PEST通过对含有磷酸基团的信号分子的去磷酸化作用在细胞迁移、细胞增殖及细胞分化等生理过程中发挥着关键的作用。目前,研究者们发现PTPPEST蛋白水平的降低与已知的几种癌症相关,但有关PEST功能及PEST对肿瘤的发生发展的研究报道仍十分有限,需要进一步探讨PEST对肿瘤细胞的影响。CRISPR/Cas9是一项全新基因编辑技术,它具有高效率、高特异性、高精准度等优点,并且操作简单、快速,近年来迅速发展成为炙手可热的新方法。CRISPR/Cas9系统由CRISPR相关基因和Cas9核酸内切酶组成。利用与目的基因同源的sgRNA,特异性结合靶细胞基因组的DNA序列,形成杂合双链。C... 

【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：68 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
英文缩写词
第1章 绪论
    1.1 蛋白质磷酸酶的概述
        1.1.1 蛋白质磷酸酶的概念及分类
        1.1.2 PTP-PEST
    1.2 CRISPR/Cas9 基因编辑技术
        1.2.1 CRISPR/Cas系统的组成
        1.2.2 CRISPR/Cas9 作用原理
        1.2.3 CRISPR/Cas9 技术应用
    1.3 本课题的研究目的及意义
第2章 PTPN12 基因敲除A549 稳定细胞株的构建
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验试剂
        2.1.2 菌株、载体和细胞培养
        2.1.3 实验耗材与仪器设备
        2.1.4 试剂配置
    2.2 实验方法
        2.2.1 重组质粒的构建
        2.2.2 细胞系的选择
        2.2.3 A549 稳定细胞株的筛选
        2.2.4 PTPN12 基因敲除A549 稳定细胞株的鉴定
    2.3 结果及分析
        2.3.1 重组质粒的构建
        2.3.2 PTP-PEST在不同细胞系中的表达水平
        2.3.3 PTPN12 基因敲除A549 稳定细胞株
    2.4 本章小结
第3章 PTPN12 基因对A549 细胞增殖、迁移的影响
    3.1 实验材料
        3.1.1 实验试剂
        3.1.2 实验耗材与仪器
        3.1.3 溶液配置
        3.1.4 菌株、载体、细胞
    3.2 实验方法
        3.2.1 细胞原位计数试验
        3.2.2 CCK-8 细胞增殖的检测
        3.2.3 吉姆萨细胞染色
        3.2.4 细胞周期的检测
        3.2.5 细胞划痕实验
        3.2.6 统计学分析
    3.3 实验结果
        3.3.1 细胞原位计数实验结果
        3.3.2 CCK8 细胞增殖实验结果
        3.3.3 吉姆萨细胞染色实验结果
        3.3.4 细胞周期的检测结果
        3.3.5 细胞划痕实验结果
    3.4 本章小结
讨论
参考文献
作者简介
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]基因编辑技术:进展与挑战[J]. 卢俊南,褚鑫,潘燕平,陈映羲,温栾,戴俊彪.  中国科学院院刊. 2018(11)
[2]CRISPR/Cas9技术的脱靶效应及优化策略[J]. 郭全娟,韩秋菊,张建.  生物化学与生物物理进展. 2018(08)
[3]利用CRISPR/Cas9n double nick系统构建人DNAH2基因敲除的U2OS细胞株[J]. 常丽贤,孙聪聪,陈晓娟,杨文钰,张家源,张英弛,袁卫平,竺晓凡.  生物工程学报. 2017(02)
[4]CRISPR/Cas9的应用及脱靶效应研究进展[J]. 郑武,谷峰.  遗传. 2015(10)



本文编号：3147648