长野芽孢杆菌普鲁兰酶基因在枯草芽孢杆菌中的整合表达
发布时间：2021-04-22 06:52
长野芽孢杆菌（Bacillus naganoensis）来源的普鲁兰酶（GenBankNo.JN872757.1）在高温、酸性环境条件下有较好的耐受性,满足淀粉工业中糖化过程的要求,可以提高淀粉质原料的利用率,提高工业生产的效率。枯草芽孢杆菌是食品级生产菌株,具有完善的蛋白转录翻译和分泌系统。因此,本研究通过同源重组,将长野芽孢杆菌普鲁兰酶基因整合在枯草芽孢杆菌基因组中进行表达,构建了分别包含组成型启动子PHpaⅡ和诱导型启动子PsacB的枯草芽孢杆菌表达系统,并对酶活较高的重组菌进行了发酵优化,主要内容如下:（1）从以往构建的穿梭质粒pMA0911-PHpaⅡ-pul中获得普鲁兰酶基因表达框PHpⅡ-pul,构建了枯草芽孢杆菌整合载体pDL-PHpaⅡ-pul,并将普鲁兰酶基因分别整合在B.subtilisWB600和B.subtilisWB800的基因组中实现胞外表达,经过72 h发酵,重组菌B.subtilis WB800-PHpaⅡ-pul（以下简称8H）和B.subtilis WB600-PHpa Ⅱ-pul（以下简称6H）的胞外酶活分别为30.32U·mL-1和18.83U...
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：44 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
1.1 普鲁兰酶概述
1.2 普鲁兰酶的研究进展
1.2.1 普鲁兰酶的产酶微生物及其酶学性质
1.2.2 普鲁兰酶异源表达的研究进展
1.3 枯草芽孢杆菌表达系统
1.3.1 概述
1.3.2 枯草芽孢杆菌宿主菌株
1.3.3 枯草芽孢杆菌的启动子
1.4 枯草芽孢杆菌整合载体
1.4.1 枯草芽孢杆菌整合载体的整合机理
1.4.2 枯草芽孢杆菌整合载体的整合方式
1.5 本课题的立题意义与研究内容
第二章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 供试菌株,质粒与引物
2.1.2 主要试剂
2.1.3 培养基与溶液
2.1.4 主要仪器
2.2 实验方法
2.2.1 枯草芽孢杆菌整合质粒的构建
2.2.2 枯草芽孢杆菌感受态的制备与转化
2.2.3 重组菌株的筛选与鉴定
2.2.4 重组菌株生长曲线和发酵曲线的测定
2.2.5 诱导型重组菌株的表达与诱导条件的优化
2.2.6 普鲁兰酶表达的SDS-PAGE分析
2.2.7 普鲁兰酶酶活的测定
第三章 结果与讨论
HpaⅡ-pul和pDL-PsacB-pul的构建"> 3.1 整合质粒pDL-PHpaⅡ-pul和pDL-PsacB-pul的构建
3.1.1 普鲁兰酶基因表达框的扩增
HpaⅡ-pul的构建"> 3.1.2 整合质粒pDL-PHpaⅡ-pul的构建
sacB-pul的构建"> 3.1.3 整合质粒pDL-PsacB-pul的构建
3.2 枯草芽孢杆菌整合菌株的筛选与鉴定
3.2.1 氯霉素筛选枯草芽孢杆菌转化菌株浓度的确定
3.2.2 枯草芽孢杆菌整合菌株基因组的鉴定
3.3 组成型重组菌株的表达与发酵优化
3.3.1 重组菌普鲁兰酶的表达分析
3.3.2 重组菌8H发酵条件的优化
3.3.3 最佳发酵条件下的发酵过程曲线
3.4 诱导型重组菌株的表达与诱导条件的优化
3.4.1 蔗糖诱导型重组菌株的表达
3.4.2 蔗糖诱导表达条件的优化
3.4.3 最佳诱导条件下的发酵过程曲线
主要结论与展望
致谢
参考文献
附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]凹凸棒土对阳离子淀粉的吸附性能及其在纸浆中的应用[J]. 高庆春,程金兰,杜书兰,张皓羽. 林业工程学报. 2019(02)
[2]淀粉种类与结构对其上浆性能的影响[J]. 范雪荣,潘鹏. 棉纺织技术. 2018(11)
[3]枯草芽孢杆菌表达系统及其启动子研究进展[J]. 余小霞,田健,刘晓青,伍宁丰. 生物技术通报. 2015(02)
[4]一个新型耐热普鲁兰酶的结构与功能[J]. 甄杰,胡政,李树芳,徐健勇,宋诙. 生物工程学报. 2014(01)
[5]长野芽孢杆菌普鲁兰酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达及酶学性质研究[J]. 张艳,路福平,刘逸寒,李玉,张春峰. 生物技术通报. 2012(07)
[6]小麦淀粉流变学特性分析[J]. 袁超,刘亚伟. 粮食与油脂. 2005(02)
硕士论文
[1]普鲁兰酶基因在重组枯草芽孢杆菌中的表达调控元件优化[D]. 邓怡.江南大学 2018
[2]高强度凝胶堵水工艺实验研究[D]. 苏鑫.东北石油大学 2017
[3]长野芽胞杆菌（Bacillus naganoensis）普鲁兰酶的高效表达与分泌调控[D]. 严伟.江南大学 2013
[4]双亲性淀粉衍生物的制备及其应用[D]. 宋师伟.北京化工大学 2008
本文编号：3153338
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：44 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
1.1 普鲁兰酶概述
1.2 普鲁兰酶的研究进展
1.2.1 普鲁兰酶的产酶微生物及其酶学性质
1.2.2 普鲁兰酶异源表达的研究进展
1.3 枯草芽孢杆菌表达系统
1.3.1 概述
1.3.2 枯草芽孢杆菌宿主菌株
1.3.3 枯草芽孢杆菌的启动子
1.4 枯草芽孢杆菌整合载体
1.4.1 枯草芽孢杆菌整合载体的整合机理
1.4.2 枯草芽孢杆菌整合载体的整合方式
1.5 本课题的立题意义与研究内容
第二章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 供试菌株,质粒与引物
2.1.2 主要试剂
2.1.3 培养基与溶液
2.1.4 主要仪器
2.2 实验方法
2.2.1 枯草芽孢杆菌整合质粒的构建
2.2.2 枯草芽孢杆菌感受态的制备与转化
2.2.3 重组菌株的筛选与鉴定
2.2.4 重组菌株生长曲线和发酵曲线的测定
2.2.5 诱导型重组菌株的表达与诱导条件的优化
2.2.6 普鲁兰酶表达的SDS-PAGE分析
2.2.7 普鲁兰酶酶活的测定
第三章 结果与讨论
HpaⅡ-pul和pDL-PsacB-pul的构建"> 3.1 整合质粒pDL-PHpaⅡ-pul和pDL-PsacB-pul的构建
3.1.1 普鲁兰酶基因表达框的扩增
HpaⅡ-pul的构建"> 3.1.2 整合质粒pDL-PHpaⅡ-pul的构建
sacB-pul的构建"> 3.1.3 整合质粒pDL-PsacB-pul的构建
3.2 枯草芽孢杆菌整合菌株的筛选与鉴定
3.2.1 氯霉素筛选枯草芽孢杆菌转化菌株浓度的确定
3.2.2 枯草芽孢杆菌整合菌株基因组的鉴定
3.3 组成型重组菌株的表达与发酵优化
3.3.1 重组菌普鲁兰酶的表达分析
3.3.2 重组菌8H发酵条件的优化
3.3.3 最佳发酵条件下的发酵过程曲线
3.4 诱导型重组菌株的表达与诱导条件的优化
3.4.1 蔗糖诱导型重组菌株的表达
3.4.2 蔗糖诱导表达条件的优化
3.4.3 最佳诱导条件下的发酵过程曲线
主要结论与展望
致谢
参考文献
附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]凹凸棒土对阳离子淀粉的吸附性能及其在纸浆中的应用[J]. 高庆春,程金兰,杜书兰,张皓羽. 林业工程学报. 2019(02)
[2]淀粉种类与结构对其上浆性能的影响[J]. 范雪荣,潘鹏. 棉纺织技术. 2018(11)
[3]枯草芽孢杆菌表达系统及其启动子研究进展[J]. 余小霞,田健,刘晓青,伍宁丰. 生物技术通报. 2015(02)
[4]一个新型耐热普鲁兰酶的结构与功能[J]. 甄杰,胡政,李树芳,徐健勇,宋诙. 生物工程学报. 2014(01)
[5]长野芽孢杆菌普鲁兰酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达及酶学性质研究[J]. 张艳,路福平,刘逸寒,李玉,张春峰. 生物技术通报. 2012(07)
[6]小麦淀粉流变学特性分析[J]. 袁超,刘亚伟. 粮食与油脂. 2005(02)
硕士论文
[1]普鲁兰酶基因在重组枯草芽孢杆菌中的表达调控元件优化[D]. 邓怡.江南大学 2018
[2]高强度凝胶堵水工艺实验研究[D]. 苏鑫.东北石油大学 2017
[3]长野芽胞杆菌（Bacillus naganoensis）普鲁兰酶的高效表达与分泌调控[D]. 严伟.江南大学 2013
[4]双亲性淀粉衍生物的制备及其应用[D]. 宋师伟.北京化工大学 2008
本文编号：3153338
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3153338.html
