小鼠PKM1基因慢病毒过表达载体的构建和稳定转染C 2 C 12 细胞株的筛选及其对糖酵解的影响

发布时间：2021-05-09 16:54

　　本研究旨在构建含小鼠PKM1基因的慢病毒过表达载体,筛选稳定过表达PKM1的C₂C₁₂细胞株,初步检测PKM1对细胞糖酵解的影响。提取小鼠背最长肌总RNA并反转录合成cDNA。用"Golden20Gate"法构建带FLAG标签的PKM1表达载体并转染293T细胞,进行慢病毒包装并检测慢病毒滴度。转染C₂C₁₂细胞并优化转染条件,根据载体携带的抗性基因puro,用嘌呤霉素筛选稳转株。通过qPCR和Western20Blot从转录水平和翻译水平检测目的基因的表达。通过测定细胞培养基的pH、乳酸含量以及葡萄消耗量检测PKM1对糖酵解的影响。结果表明小鼠PKM1基因慢病毒载体构建成功,慢病毒滴度为3.4×10⁸20TU/mL。慢病毒侵染靶细胞的最佳感染复数为30,筛选稳转细胞株所用嘌呤霉素的最佳浓度为1.2μg/mL。显微镜下观察病毒转导效果良好,荧光率达80%以上。过表达组中FLAG-PKM1的mRNA表达量约是空载体组的9.4万倍。FLAG-PKM1融合蛋白成功在宿主细胞内表达。与... 

【文章来源】：食品工业科技. 2020,41(10)北大核心

【文章页数】：8 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 材料与仪器
    1.2 实验方法
        1.2.1 Golden Gate法构建表达载体
            1.2.1.1 总RNA提取
            1.2.1.2 反转录合成cDNA第一链
            1.2.1.3 引物设计
            1.2.1.4 目的片段的扩增回收
            1.2.1.5 目的片段与T载体连接
            1.2.1.6 加酶切位点
            1.2.1.7 入门载体的构建
            1.2.1.8 表达载体构建
        1.2.2 慢病毒包装
            1.2.2.1 293T细胞培养
            1.2.2.2 转染293T细胞
            1.2.2.3 慢病毒收集浓缩
            1.2.2.4 qPCR法测定慢病毒滴度
        1.2.3 转染条件的优化
            1.2.3.1 最佳MOI值的确定
            1.2.3.2 最佳抗生素筛选浓度的确定
        1.2.4 稳转细胞株的筛选
            1.2.4.1 细胞准备
            1.2.4.2 病毒转导
            1.2.4.3 细胞纯化
        1.2.5 RT-qPCR检测目的基因mRNA表达量
            1.2.5.1 细胞总RNA提取
            1.2.5.2 总RNA反转录
            1.2.5.3 荧光定量PCR
        1.2.6 Western Blot检测目的蛋白的表达量
            1.2.6.1 诱导细胞分化
            1.2.6.2 蛋白提取
            1.2.6.3 SDS-PAGE电泳
            1.2.6.4 转膜
            1.2.6.5 封闭
            1.2.6.6 抗体孵育及显色成像
        1.2.7 细胞培养基的pH和乳酸含量测定
            1.2.7.1 pH测定
            1.2.7.2 乳酸含量测定
        1.2.8 C2C12细胞的葡萄糖消耗试验
    1.3 数据处理
2 结果与分析
    2.1 总RNA完整性和纯度检测
    2.2 目的片段扩增
    2.3 表达载体的酶切鉴定
    2.4 慢病毒滴度测定
    2.5 转染条件的优化
    2.6 qPCR检测目的基因mRNA表达量
    2.7 Western Blot检测目的蛋白的表达量
    2.8 细胞培养基的pH和乳酸含量以及葡萄糖消耗量测定
3 结论


【参考文献】：
期刊论文
[1]PKM220promotes20reductive20glutamine20metabolism[J]. Miao Liu,Yuanyuan Wang,Yuxia Ruan,Changsen Bai,Li Qiu,Yanfen Cui,Guoguang Ying,Binghui Li.  Cancer Biology & Medicine. 2018(04)



本文编号：3177674