纤维小体关键元件胞内自组装体系构建研究
发布时间：2021-05-11 11:15
纤维小体是附着在部分厌氧微生物细胞壁外的一种天然多酶复合体,可以高效催化降解木质纤维素,其结构稳定性强,组装灵活。目前依靠纤维小体在多种微生物表面实现了多酶系统的高效聚合,在提高多酶协同效率方面具有较大的应用潜力,但其在细胞内始终无法实现自组装。本研究选定纤维小体为胞内自组装体系的基本模型,并选择其关键元件（对接蛋白及粘连蛋白）作为主要研究对象,以大肠杆菌为平台,着重对其自组装机制进行探索与分析,并采用理性设计方法对对接蛋白进行定向改造,再结合实验寻找适合在胞内组装的突变方向,并构建适用于高通量筛选的流式筛选体系,为以纤维小体为模型的胞内自组装体系的成功构建夯实基础。研究结果分为以下三个方面:（1）选择已解析出其晶体结构的I型对接蛋白Doc A和粘连蛋白Coh作为研究对象,下载其三维结构并用Py MOL等软件进行分析,发现对接蛋白有2个钙离子结合位点。后将两蛋白分别在大肠杆菌中进行表达,再利用分子互作仪对两蛋白的结合机制进行初步探究。研究发现,对接蛋白和粘连蛋白的稳定结合需要5×10-4 mol/L左右的钙离子浓度的参与,当钙离子浓度在0～5×10-3<...
【文章来源】：齐鲁工业大学山东省
【文章页数】：79 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第1章 绪论
1.1 引言
1.2 多酶复合体
1.2.1 多酶复合体简介
1.2.2 胞内多酶复合体的研究现状
1.3 天然多酶自组装体系——纤维小体
1.3.1 纤维小体简介
1.3.2 热纤梭菌的纤维小体
1.3.3 以纤维小体为基础的催化体系的设计进展
1.4 研究的内容及意义
1.4.1 研究内容
1.4.2 研究意义
第2章 自组装体系的选择与表达
2.1 引言
2.2 实验材料
2.2.1 菌株与质粒
2.2.2 主要试剂
2.2.3 培养基与溶液
2.2.4 主要仪器
2.3 实验方法
2.3.1 目的蛋白的筛选及获得
2.3.2 蛋白DocA-G与蛋白Coh的表达与纯化
2.3.3 蛋白DocA-G与蛋白Coh结合机制的初步探究
2.4 结果与讨论
2.4.1 蛋白Coh与对接蛋白DocA-G的表达与纯化
2.4.2 粘连蛋白与对接蛋白对接机制的探究
2.5 本章小结
第3章 对接蛋白的设计及验证
3.1 引言
3.2 实验材料
3.2.1 菌株与质粒
3.2.2 主要试剂
3.2.3 培养基与溶液
3.2.4 主要仪器
3.3 实验方法
3.3.1 单位点突变体的设计及获得
3.3.2 双位点突变体的设计及获得
3.3.3 对接突变蛋白的表达及纯化
3.3.4 突变体与蛋白Coh结合对钙离子依赖性检测
3.4 结果与讨论
3.4.1 单位点突变体与蛋白Coh结合机制的探究
3.4.2 双位点突变体与蛋白Coh结合机制的探究
3.4.3 单、双位点突变体与蛋白Coh结合的比较
3.5 本章小结
第4章 关键元件-荧光蛋白融合及流式筛选体系构建
4.1 引言
4.2 实验材料
4.2.1 菌株与质粒
4.2.2 主要试剂
4.2.3 培养基与溶液
4.2.4 主要仪器
4.3 实验方法
4.3.1 表面展示体系的构建
4.3.2 基于两种荧光信号的流式筛选体系的初步构建
4.3.3 基于一种荧光信号的流式筛选体系的初步构建
4.4 结果与讨论
4.4.1 表面展示体系的构建
4.4.2 纤维小体元件-荧光蛋白融合构建
4.4.3 基于一种荧光信号的流式筛选体系的初步构建
4.5 本章小结
第5章 总结与展望
5.1 研究总结
5.2 未来展望
参考文献
致谢
在学期间主要科研成果
【参考文献】：
期刊论文
[1]利用SpyTag/SpyCatcher构建胞内自组装多酶复合体实现高效生物合成[J]. 刘璐,殷亮,黄飞,张勇,刘倩,冯雁. 中国生物工程杂志. 2018(07)
[2]冰晶核蛋白及其在细菌表面展示技术中的应用[J]. 李明亚,林陈水. 氨基酸和生物资源. 2016(02)
[3]重组柞蚕抗菌肽AD对E.coli抗菌机制研究[J]. 张倩,邓平建,王兴顺,李浩,杨小柯,耿艺介. 中国热带医学. 2014(11)
[4]蛹拟青霉液体深层发酵菌丝体抗氧化活性和抑菌活性分析[J]. 邵颖,陈安徽,陈宏伟. 食品工业. 2011(07)
博士论文
[1]自组装多酶纳米反应器的设计与构建[D]. 殷亮.上海交通大学 2018
[2]大肠杆菌多酶自组装合成衣康酸及代谢工程研究[D]. 杨中伟.华东理工大学 2018
[3]基于纤维小体脚手架蛋白的多酶共展示体系构建[D]. 王亮亮.南京林业大学 2016
本文编号：3181309
【文章来源】：齐鲁工业大学山东省
【文章页数】：79 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第1章 绪论
1.1 引言
1.2 多酶复合体
1.2.1 多酶复合体简介
1.2.2 胞内多酶复合体的研究现状
1.3 天然多酶自组装体系——纤维小体
1.3.1 纤维小体简介
1.3.2 热纤梭菌的纤维小体
1.3.3 以纤维小体为基础的催化体系的设计进展
1.4 研究的内容及意义
1.4.1 研究内容
1.4.2 研究意义
第2章 自组装体系的选择与表达
2.1 引言
2.2 实验材料
2.2.1 菌株与质粒
2.2.2 主要试剂
2.2.3 培养基与溶液
2.2.4 主要仪器
2.3 实验方法
2.3.1 目的蛋白的筛选及获得
2.3.2 蛋白DocA-G与蛋白Coh的表达与纯化
2.3.3 蛋白DocA-G与蛋白Coh结合机制的初步探究
2.4 结果与讨论
2.4.1 蛋白Coh与对接蛋白DocA-G的表达与纯化
2.4.2 粘连蛋白与对接蛋白对接机制的探究
2.5 本章小结
第3章 对接蛋白的设计及验证
3.1 引言
3.2 实验材料
3.2.1 菌株与质粒
3.2.2 主要试剂
3.2.3 培养基与溶液
3.2.4 主要仪器
3.3 实验方法
3.3.1 单位点突变体的设计及获得
3.3.2 双位点突变体的设计及获得
3.3.3 对接突变蛋白的表达及纯化
3.3.4 突变体与蛋白Coh结合对钙离子依赖性检测
3.4 结果与讨论
3.4.1 单位点突变体与蛋白Coh结合机制的探究
3.4.2 双位点突变体与蛋白Coh结合机制的探究
3.4.3 单、双位点突变体与蛋白Coh结合的比较
3.5 本章小结
第4章 关键元件-荧光蛋白融合及流式筛选体系构建
4.1 引言
4.2 实验材料
4.2.1 菌株与质粒
4.2.2 主要试剂
4.2.3 培养基与溶液
4.2.4 主要仪器
4.3 实验方法
4.3.1 表面展示体系的构建
4.3.2 基于两种荧光信号的流式筛选体系的初步构建
4.3.3 基于一种荧光信号的流式筛选体系的初步构建
4.4 结果与讨论
4.4.1 表面展示体系的构建
4.4.2 纤维小体元件-荧光蛋白融合构建
4.4.3 基于一种荧光信号的流式筛选体系的初步构建
4.5 本章小结
第5章 总结与展望
5.1 研究总结
5.2 未来展望
参考文献
致谢
在学期间主要科研成果
【参考文献】：
期刊论文
[1]利用SpyTag/SpyCatcher构建胞内自组装多酶复合体实现高效生物合成[J]. 刘璐,殷亮,黄飞,张勇,刘倩,冯雁. 中国生物工程杂志. 2018(07)
[2]冰晶核蛋白及其在细菌表面展示技术中的应用[J]. 李明亚,林陈水. 氨基酸和生物资源. 2016(02)
[3]重组柞蚕抗菌肽AD对E.coli抗菌机制研究[J]. 张倩,邓平建,王兴顺,李浩,杨小柯,耿艺介. 中国热带医学. 2014(11)
[4]蛹拟青霉液体深层发酵菌丝体抗氧化活性和抑菌活性分析[J]. 邵颖,陈安徽,陈宏伟. 食品工业. 2011(07)
博士论文
[1]自组装多酶纳米反应器的设计与构建[D]. 殷亮.上海交通大学 2018
[2]大肠杆菌多酶自组装合成衣康酸及代谢工程研究[D]. 杨中伟.华东理工大学 2018
[3]基于纤维小体脚手架蛋白的多酶共展示体系构建[D]. 王亮亮.南京林业大学 2016
本文编号：3181309
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3181309.html
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