铜胺氧化酶在氮限制诱导小球藻油脂积累中的作用

发布时间：2021-05-20 03:37

　　特定环境可改变微藻细胞内碳素分配,促使某一类碳基化合物在细胞中积累,具体机制尚不明确。我们前期研究发现,在氮限制诱导小球藻（Chlorella sp.HN11）油脂积累的过程中,一个铜胺氧化酶基因2（ChlC4O2）表达上/下调倍数最高。铜胺氧化酶（CuAOs）是一类具有多种生理的功能的胺氧化酶,参与植物细胞分化和对非生物胁迫的反应,以及哺乳动物脂肪细胞的形成和分化。然而小球藻CuAOs的生理作用尚未见报导。为进一步探明小球藻ChlCAO2在氮限制诱导的油脂积累过程中的功能与作用,本研究设置了“全氮”、“氮限制”和“氮限制—氮恢复”三个处理,测定小球藻HN11在0h,24h,48h,72h及96h的CuAOs活性和ChlCAO2基因相对表达量与油脂积累的相关性。进而通过ChlC4O2超表达和RNAi载体的遗传转化获得转化藻株,测定转化藻株油脂积累和ChlCAOs酶活等表型,以期探明ChlCAO2在氮限制诱导小球藻油脂积累中的作用。此外,为探明CuAO在油脂积累中的作用是否存在共性,本研究还测定了在“全氮”、“氮限制”和“氮限制—氮恢复”三个处理下,另外一株小球藻（C.vulgaris ... 

【文章来源】：海南大学海南省 211工程院校

【文章页数】：93 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
1 前言
    1.1 微藻应用现状
    1.2 微藻油脂积累的机制研究进展
    1.3 铜胺氧化酶研究进展
    1.4 小球藻基因工程的研究进展
        1.4.1 小球藻转化方法
        1.4.2 小球藻转基因研究进展
    1.5 研究目的与意义
2 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验藻株、菌株以及质粒载体
        2.1.2 培养基
        2.1.3 主要试剂
        2.1.4 仪器设备
    2.2 小球藻铜胺氧化酶基因ChlCAO2克隆
        2.2.1 藻株培养
        2.2.2 RNA提取
        2.2.3 cDNA第一链的合成
        2.2.4 设计引物
        2.2.5 逆转录PCR扩增
        2.2.6 回收纯化PCR产物
        2.2.7 连接转化
        2.2.8 RACE扩增
        2.2.9 生物信息学分析
    2.3 铜胺氧化酶与油脂积累的相关性分析
        2.3.1 藻株培养
        2.3.2 限氮处理
        2.3.3 几株微藻的生长量和油脂含量测定
        2.3.4 铜胺氧化酶活性的测定
        2.3.5 铜胺氧化酶基因的表达
        2.3.6 数据分析
    2.4 载体构建
        2.4.1 超表达载体构建
        2.4.2 RNAi载体构建
    2.5 小球藻转化体系的建立
        2.5.1 抗生素敏感性测定
        2.5.2 农杆菌转化小球藻
        2.5.3 阳性转化藻株的鉴定
    2.6 ChlCAO2超表达和RNAi载体的转化
        2.6.1 农杆菌的转化
        2.6.2 农杆菌介导小球藻转化
    2.7 转基因藻株表型分析
        2.7.1 限氮处理
        2.7.2 生长量和油脂含量测定
        2.7.3 铜胺氧化酶活性和表达量测定
3 结果与分析
    3.1 ChlCAO2全长序列的获得和分析
        3.1.1 ChlCAO2全长序列的获得
        3.1.2 蛋白质序列的同源性分析和系统发育分析
        3.1.3 预测蛋白的结构分析
    3.2 三种绿藻铜胺氧化酶与油脂积累相关性
        3.2.1 小球藻HN11铜胺氧化酶与油脂积累相关性
        3.2.2 莱茵衣藻铜胺氧化酶与油脂积累相关性
        3.2.3 限氮处理小球藻C3铜胺氧化酶油脂与相关性分析
    3.3 载体构建
        3.3.1 超表达载体构建
        3.3.2 RNAi载体构建
    3.4 小球藻遗传转化体系的建立
        3.4.1 小球藻HN11抗生素敏感性测定
        3.4.2 农杆菌介导小球藻遗传转化
    3.5 ChlCAO2在小球藻油脂产生过程中的功能分析
        3.5.1 小球藻超表达载体和RNAi载体的遗传转化
        3.5.2 转化藻株表型分析
4 讨论
    4.1 氮胁迫对微藻的影响
    4.2 微藻油脂积累与铜胺氧化酶相关性
5 总结与展望
参考文献
缩略词表
附录1
附录2
致谢



本文编号：3197010