GH46家族壳聚糖酶的结构解析与催化机理研究

发布时间：2021-05-23 14:14

　　壳寡糖具有多种独特的生理功能,其活性与聚合度和乙酰化程度有很大关系。壳聚糖酶能专一性降解壳聚糖制备壳寡糖,催化效率高,产物易于分离,反应条件温和,具有工业应用的价值。已报道的壳聚糖酶大多遵从内切型反应机制,其水解产物聚合度分布随机、乙酰化位点复杂,水解终产物多为壳二糖、壳三糖等短链寡糖产物。因此,了解壳聚糖酶产物聚合度差异的分子机制,研究特定聚合度区间壳寡糖酶法制备具有重要意义。本课题旨在利用X-射线晶体法解析GH46家族壳聚糖酶的复合物晶体结构,了解GH46家族壳聚糖酶的底物结合机制及催化机理,探索壳聚糖酶产物聚合度差异的分子机制。首先,利用X-射线晶体法成功解析了植物内生菌Gynuella sunshinyii来源的GH46壳聚糖酶GsCsn46A和解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens来源的GH46壳聚糖酶BaCsn46A与壳四糖、壳五糖的复合物结构。阐明了 GH46家族壳聚糖酶与壳寡糖底物（-5—+3位点）的详细结合机制,发现了 GH46家族壳聚糖酶催化凹槽非还原端的3个底物结合新位点。其次,复合物结构显示GsCsn46A的催化凹槽中糖链底物均结合于... 

【文章来源】：华东理工大学上海市 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：82 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
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第1章 绪论
    1.1 课题背景及意义
    1.2 国内外研究进展
        1.2.2 壳聚糖酶概述
        1.2.3 GH46家族壳聚糖酶研究现状
    1.3 研究目的、内容与技术路线
        1.3.1 研究目的
        1.3.2 研究内容
        1.3.3 技术路线
第2章 植物内生菌来源壳聚糖酶GsCsn46A的蛋白结晶与结构解析
    2.1 引言
    2.2 材料与仪器
    2.3 实验方法
        2.3.1 GsCsn46A突变体的构建表达
        2.3.2 蛋白含量的测定
        2.3.3 壳聚糖酶活性测定
        2.3.4 GsCsn46A的晶体制备与筛选
        2.3.5 蛋白晶体衍射数据的收集和处理
    2.4 结果与讨论
        2.4.1 GsCsn46A的表达与纯化
        2.4.2 GsCsn46A的晶体筛选与优化
        2.4.3 GsCsn46A活性中心突变体的构建
        2.4.4 GsCsn46A突变体的表达与纯化
        2.4.5 GsCsn46A复合物晶体的筛选与优化结果
        2.4.6 GsCsn46A复合物整体结构
    2.5 本章小结
第3章 解淀粉芽孢杆菌来源壳聚糖酶BaCsn46A的蛋白结晶与结构解析
    3.1 引言
    3.2 材料与仪器
    3.3 实验方法
        3.3.1 BaCsn46A突变体的构建表达
        3.3.2 蛋白含量的测定
        3.3.3 壳聚糖酶活性测定
        3.3.4 BaCsn46A的晶体制备与筛选
        3.3.5 蛋白晶体衍射数据的收集和处理
    3.4 结果与讨论
        3.4.1 BaCsn46A的表达与纯化
        3.4.2 BaCsn46A的晶体筛选与优化
        3.4.3 壳聚糖酶BaCsn46A活性中心突变体的构建
        3.4.4 壳聚糖酶BaCsn46A突变体的表达与纯化
        3.4.5 BaCsn46A复合物晶体的筛选与优化
        3.4.6 BaCsn46A复合物整体结构
    3.5 本章小结
第4章 GH46家族壳聚糖酶底物结合机制与催化机理研究
    4.1 引言
    4.2 材料与仪器
    4.3 实验方法
        4.3.1 壳聚糖酶突变体的构建表达
        4.3.2 蛋白含量测定
        4.3.3 壳聚糖酶突变体的活性测定
        4.3.4 壳聚糖酶突变体的酶解产物TLC检测
    4.4 结果与讨论
        4.4.1 两种壳聚糖酶的结构对比分析
        4.4.2 GH46家族壳聚糖酶与壳寡糖的相互作用
        4.4.3 GH46壳聚糖酶的底物识别机制与催化机理
        4.4.4 壳聚糖酶突变体的表达与纯化
        4.4.5 壳聚糖酶突变体的酶活性测定
        4.4.6 壳聚糖酶突变体的酶解产物分析
        4.4.7 壳聚糖酶突变体的筛选结果
    4.5 本章小结
第5章 结论与展望
    5.1 结论
    5.2 创新点
    5.3 展望
参考文献
致谢
攻读硕士期间论文及专利发表情况


【参考文献】：
期刊论文
[1]枯草芽孢杆菌壳聚糖酶在毕赤酵母中的高效表达及其酶解特性[J]. 马帅,杨绍青,刘翊昊,闫巧娟,江正强.  食品科学. 2019(14)
[2]壳聚糖酶解液的纳滤分离技术研究[J]. 于沛沛,夏文水,仲伟伟,刘晓丽,王斌.  食品与机械. 2018(11)
[3]毕赤酵母表达解淀粉芽孢杆菌壳聚糖酶及其水解制备可控结构壳寡糖[J]. 程功,焦思明,冯翠,贾培媛,任立世,杜昱光.  食品科学. 2019(08)
[4]产壳聚糖酶菌株ncps116发酵条件优化及其酶学性质[J]. 张翔,张彦昊,刘孝永,辛雪,王易芬,陈蕾蕾,周庆新,赵双枝.  化工进展. 2018(06)
[5]壳聚糖酶的研究进展[J]. 韩玉娟,王华,路新枝.  中国海洋药物. 2018(02)
[6]壳聚糖酶的研究进展[J]. 黄惠莉,朱利平.  食品工业科技. 2012(06)
[7]壳聚糖酶的分离纯化及其特性研究[J]. 任晶,赵华,王虹,王希.  天津科技大学学报. 2010(06)
[8]壳聚糖酶的研究进展[J]. 单晓雪,郑人源,张涛,王玉明.  成都医学院学报. 2007(Z1)
[9]青霉菌产壳聚糖酶制备低分子量壳聚糖的研究[J]. 方文建,隋斯光,郑连英.  中国医药工业杂志. 2006(02)

博士论文
[1]壳聚糖酶OU01底物结合与催化机理研究[D]. 律倩倩.中国海洋大学 2015



本文编号：3202673