高可溶性绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的表达分析

发布时间：2021-05-25 08:18

　　随着基因组学、生物信息学和蛋白质组学的快速发展,大量未知蛋白质的功能需要鉴定。融合蛋白标签技术的发展,为研究蛋白质的细胞内定位、相互作用和分离纯化等提供了有效的工具。目前已有许多融合标签系统在重组蛋白质表达中得到广泛应用。但仍存在操作程序复杂、成本昂贵和周期长等问题。一个理想的蛋白质标签是由基因编码,在体内和体外均能起作用,且提供一个敏感的分析信号,并不影响甚至促进目的蛋白质的可溶性表达。在原核表达系统中,未经改造的绿色荧光蛋白（wild type GFP,wtGFP）的表达产物大部分是不可溶的,即易形成包涵体。其作为一种报告基因,以其独特的优势广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移及相互作用、信号传递、转染与转化,以及细胞的分离与纯化等研究领域。其折叠易受温度影响,发光较弱,应用到某些多层植物细胞中不容易观察。后期改造的增强型GFP（enhanced GFP,eGFP）荧光强度得到提高,但在原核表达系统中其产物也只是少部分可溶。其若作为应用标签,不利于可溶性重组蛋白结构、功能和生化性质的研究。本实验以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）为研... 

【文章来源】：聊城大学山东省

【文章页数】：58 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
前言
第一章 绪论
    1.1 大肠杆菌基因表达系统
        1.1.1 表达宿主菌
        1.1.2 表达载体
    1.2 外源蛋白可溶性表达策略
        1.2.1 寄主菌株的选择
        1.2.2 载体的选择
        1.2.3 改变培养参数
        1.2.4 密码子优化
    1.3 绿色荧光蛋白
        1.3.1 GFP的来源、结构及发光机制
        1.3.2 突变GFP功能研究现状
        1.3.3 GFP在生物领域的最新应用进展
第二章 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌株与质粒
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要仪器设备
        2.1.4 PCR引物、目的基因合成和测序
        2.1.5 培养基与主要溶液配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 氯化钙法制备新鲜的大肠杆菌DH5α感受态
        2.2.2 目的片段的获取方法
        2.2.3 酶切反应
        2.2.4 纯化目的片段与载体
        2.2.5 连接反应
        2.2.6 质粒或连接产物转化
        2.2.7 菌落PCR快速筛选与鉴定重组子
        2.2.8 质粒DNA的提取
        2.2.9 琼脂糖凝胶电泳分析
        2.2.10 表达载体pET-eGFP和 p ET-sGFP的构建
        2.2.11 荧光强度测定
        2.2.12 诱导蛋白表达
        2.2.13 SDS-PAGE电泳
        2.2.14 sGFP浓度与其荧光强度之间的对应关系
第三章 结果与分析
    3.1 表达载体的构建
        3.1.1 扩增基因eGFP
        3.1.2 重组质粒p ET-eGFP、pET-sGFP的鉴定
    3.2 荧光蛋白诱导表达分析
        3.2.1 最佳IPTG诱导浓度鉴定
        3.2.2 荧光强度分析
    3.3 荧光蛋白SGFP的可溶性验证
    3.4 SGFP标准曲线
第四章 讨论与展望
    4.1 讨论
    4.2 展望
参考文献
附录
    缩略语表
致谢
攻读硕士学位期间发表的学术论文



本文编号：3205010