一种铜锌超氧化物歧化酶突变体的原核表达、纯化及酶活性测定

发布时间：2021-06-19 15:49

　　目的原核表达、纯化一种铜锌超氧化物歧化酶（Cu,Zn-SOD）突变体,并检测其酶活性。方法将经热力学优化的Cu,Zn-SOD突变体基因亚克隆至pET-28a载体中,构建重组表达质粒SOD1-pET-28a,转化入大肠埃希菌BL21（DE3）中,IPTG诱导表达;在500 mL摇瓶培养条件下,通过改变加入Cu、Zn离子的量优化诱导表达条件;表达的重组蛋白经初步纯化后,测定酶活性。结果重组表达质粒SOD-pET-28a经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为15 000,主要以可溶性形式表达;工程菌株在500 mL摇瓶培养条件下培养至10 h左右,A₆₀₀至3. 5左右时加入终浓度为0. 1 mmol/L IPTG、0. 2 mmol/L ZnCl₂、0. 5 mmol/L CuSO4,可获得最佳表达量（29. 2%）;初步纯化获得的重组蛋白纯度为97. 32%,比活为5. 08×103U/mg。结论成功利用大肠埃希菌表达系统表达了一种经热力学优化的Cu,Zn-SOD突变体,初步纯化的突变体具有较好的酶活性,为进一步摸索大规模生... 

【文章来源】：中国生物制品学杂志. 2020,33(06)CSCD

【文章页数】：5 页

【部分图文】：

Cu,Zn-SOD突变体基因扩增产物电泳图

重组表达质粒SOD1-pET-28a的双酶切（NdeⅠ/HindⅢ）产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可见约500 bp的目的基因片段，见图2。经测序及BLAST分析，片段大小与目的片段核苷酸序列一致，表明重组表达质粒构建正确。2.3 表达产物的鉴定

表达产物的SDS-PAGE分析

【参考文献】：
期刊论文
[1]老年血管性痴呆患者认知功能与血清Hcy和SOD水平的关系[J]. 谢先龙,吴艳霞,吴婷玉,吴儇,王巍.  中国实用神经疾病杂志. 2018(14)
[2]非酶促糖基化SOD对四氧嘧啶诱导糖尿病大鼠的降血糖作用[J]. 赵丹,蔡丽萍,傅婷,张海玲,刘树滔,饶平凡.  中国食品学报. 2018(06)
[3]细胞外超氧化物歧化酶DNA甲基化对动脉粥样硬化的诱导作用及作用靶点[J]. 陈佳,杨晓龙,张旭峰.  中国现代医学杂志. 2018(10)
[4]表达人源SOD的毕赤酵母重组子的构建[J]. 李新鸣,孙冶,肖纯凌.  中国医科大学学报. 2017(12)
[5]番茄超氧化物歧化酶的生物信息学分析[J]. 郭笑,苑广信,王曼力,赵南晰,李洪宇,安丽萍.  北方园艺. 2016(21)
[6]异亮氨酸热分解机理的PM3研究[J]. 胡立新,陈晓耘.  湖北工学院学报. 2000(02)

硕士论文
[1]基于分子动力学分析的Mn-SOD的热稳定性研究[D]. 魏贝贝.曲阜师范大学 2018



本文编号：3238097