低纤维素酶背景里氏木霉菌株的构建和应用

发布时间：2021-07-08 00:08

　　丝状真菌里氏木霉（Trichoderma reesei）产生的纤维素酶主要包括纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶。在使用里氏木霉表达外源基因时,它们会形成较高的纤维素酶背景,而且其表达还可能会导致对细胞转录、翻译和分泌等相关资源的占用。应用CRISPR/Cas9技术,在体外组装Cas9/gRNA复合物并转化里氏木霉以定点敲除主要的纤维二糖水解酶cbh1基因,同时结合RNAi干扰技术来沉默主要的内切葡聚糖酶eg2基因,以期一步构建里氏木霉低纤维素酶背景的表达系统。获得了一株纤维素酶表达显著下降的11号转化子SUS6。该转化子中,cbh1的表达完全消失,而eg2基因的表达水平较出发菌株SUS5降低了98%。以该转化子为宿主表达外源基因NfBgl3A,两个代表性转化子的β-葡萄糖苷酶酶活最高分别为172.4和79.3 U·mL^-1,远高于以出发菌株（高纤维素酶背景）为宿主表达β-葡萄糖苷酶酶活(两个代表转化子分别为11.6和31.9 U·mL^-1)。因此,构建低纤维素酶背景的菌株作为表达宿主,还可明显的提高某些异源基因的表达水平。 

【文章来源】：中国农业科技导报. 2020,22(12)北大核心CSCD

【文章页数】：8 页

【部分图文】：

转化子中CBH1和EG2分泌表达情况

将成功构建的pEG2i质粒和Cas9/gRNA复合物转入里氏木霉SUS5菌株。理论上除了对eg2基因进行RNAi介导的基因沉默外,还能依赖于CRISPR/Cas9系统对cbh1基因进行敲除。验证引物分别设计在gRNA识别cbh1位点的前后大约250 bp处。从图1可以看出,以出发菌株SUS5作模板扩增出500 bp左右的特异性条带,和预期大小相符;以大部分转化子为模板扩增,虽然扩增出了此特异性条带,但经测序发现和基因组序列完全一致,未能发生有效的基因组编辑。而5号、8号和11号转化子均未能扩增出特异性条带。根据使用Cas9/gRNA复合物对里氏木霉基因组编辑的报道[10],里氏木霉中使用体外组装的Cas9/gRNA编辑基因时主要发生较大DNA片段的插入,这些片段包括染色体DNA、质粒DNA或污染的大肠杆菌的染色体DNA。因此,这些转化子中有可能发生cbh1基因组座位的编辑。2.2 选定转化子中CBH1和EG2分泌表达情况

SUS6菌株中NfBgl3A表达增强


本文编号：3270640