高转苷活性乳糖酶编码基因的克隆与酶学特征研究
发布时间：2021-07-13 03:55
运用鸟枪克隆术,从环状芽胞杆菌B2301基因组中克隆出乳糖酶编码基因,其完整读框大小为5 133bp,编码1 710个氨基酸残基,不含典型细菌信号肽序列,与已有报道的β-半乳糖苷酶的最高一致性为93.6%。初步表达和纯化了此乳糖酶,重组乳糖酶在50℃（ONPG）/60℃（乳糖）和pH 6.0～6.5下表现出最高催化活性,Zn2+、Fe2+、Cu2+、EDTA和SDS对重组酶表现出不同程度的抑制作用;该酶在50和55℃下催化合成低聚半乳糖的Vmax分别为2.21和2.47 g/（L·h）,Km分别为10.46和14.37 g/L。所获得的乳糖酶具有以乳糖为底物酶法合成低聚半乳糖的优良应用属性,可为后续针对此酶的高效表达与工业化应用奠定基础。
【文章来源】：食品与发酵工业. 2020,46(15)北大核心CSCD
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
Bgl Bc与其他β-半乳糖苷酶的相关关系
前人对B.circulans ATCC 31382β-半乳糖苷酶的结构功能相关关系解析研究中发现，其近N端811个氨基酸残基组成的LacZ功能域，具有完整的β-半乳糖苷酶活性[20-22]。鉴于本研究克隆获得的BglBc具有与菌株ATCC 31382β-半乳糖苷酶相似结构，本研究对其近N端782个氨基酸残基组成的功能域(BglD)在枯草杆菌WB600中成功分泌表达，表达酶活力达2.9 U/m L。进一步对发酵上清酶液进行分离纯化，获得在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)上呈现单一条带的纯酶样品(图2)。进一步确定了重组BglD的GOS合成能力，该酶催化乳糖转化为GOS的最高转化率达52.5%(数据未呈现)，与从B.circulans B2301制备的野生型乳糖酶催化合成GOS的性能相同[10]。可见，从B.circulans B2301成功克隆出的乳糖酶编码基因bglBc的截短序列bglD仍然保留了原酶分子催化合成GOS的活性。后续对其酶学性质进行进一步分析。
进一步对纯化的BglD酶学性质进行分析，结果汇总于图3和表1。以合成底物ONPG为底物时，乳糖酶BglD的最适作用温度为50℃、最适作用p H为6.0～6.5;以天然底物乳糖为底物时，其最适作用温度为60℃、最适作用pH为6.0～6.5(图3-a、3-c)。此酶在50℃以下和pH 5.5～7.0之间具有较好的稳定性(图3-b、3-d)。同时发现，作用于天然底物乳糖，BglD的最适作用温度更高，但最适作用pH没有显著差异，不同底物对其热稳定性和pH稳定性也没有显著影响(图3);BglD的最适作用温度略低于B.circulans ATCC31382的乳糖酶BglD-D[22]。
【参考文献】：
期刊论文
[1]高转苷活性乳糖酶快速筛选方法的建立与初步应用[J]. 赵继华,牛丹丹,NOKUTHULAPeace Mchunu,田康明,苗佳,王正祥. 食品与发酵工业. 2020(07)
[2]固定化酶法高效制备低聚异麦芽糖[J]. 王君,李玮,王雪荣,毛淑红,路福平,王正祥. 中国食品学报. 2017(08)
[3]解淀粉芽胞杆菌α-淀粉酶高活力突变体的创建与性质研究[J]. 牛丹丹,靳晓,吴海洋,刘晓光,林娟,叶秀云. 食品与发酵工业. 2017(10)
[4]产甘油假丝酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶编码基因的克隆[J]. 王正祥,诸葛健. 微生物学报. 1999(04)
本文编号：3281290
【文章来源】：食品与发酵工业. 2020,46(15)北大核心CSCD
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
Bgl Bc与其他β-半乳糖苷酶的相关关系
前人对B.circulans ATCC 31382β-半乳糖苷酶的结构功能相关关系解析研究中发现，其近N端811个氨基酸残基组成的LacZ功能域，具有完整的β-半乳糖苷酶活性[20-22]。鉴于本研究克隆获得的BglBc具有与菌株ATCC 31382β-半乳糖苷酶相似结构，本研究对其近N端782个氨基酸残基组成的功能域(BglD)在枯草杆菌WB600中成功分泌表达，表达酶活力达2.9 U/m L。进一步对发酵上清酶液进行分离纯化，获得在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)上呈现单一条带的纯酶样品(图2)。进一步确定了重组BglD的GOS合成能力，该酶催化乳糖转化为GOS的最高转化率达52.5%(数据未呈现)，与从B.circulans B2301制备的野生型乳糖酶催化合成GOS的性能相同[10]。可见，从B.circulans B2301成功克隆出的乳糖酶编码基因bglBc的截短序列bglD仍然保留了原酶分子催化合成GOS的活性。后续对其酶学性质进行进一步分析。
进一步对纯化的BglD酶学性质进行分析，结果汇总于图3和表1。以合成底物ONPG为底物时，乳糖酶BglD的最适作用温度为50℃、最适作用p H为6.0～6.5;以天然底物乳糖为底物时，其最适作用温度为60℃、最适作用pH为6.0～6.5(图3-a、3-c)。此酶在50℃以下和pH 5.5～7.0之间具有较好的稳定性(图3-b、3-d)。同时发现，作用于天然底物乳糖，BglD的最适作用温度更高，但最适作用pH没有显著差异，不同底物对其热稳定性和pH稳定性也没有显著影响(图3);BglD的最适作用温度略低于B.circulans ATCC31382的乳糖酶BglD-D[22]。
【参考文献】：
期刊论文
[1]高转苷活性乳糖酶快速筛选方法的建立与初步应用[J]. 赵继华,牛丹丹,NOKUTHULAPeace Mchunu,田康明,苗佳,王正祥. 食品与发酵工业. 2020(07)
[2]固定化酶法高效制备低聚异麦芽糖[J]. 王君,李玮,王雪荣,毛淑红,路福平,王正祥. 中国食品学报. 2017(08)
[3]解淀粉芽胞杆菌α-淀粉酶高活力突变体的创建与性质研究[J]. 牛丹丹,靳晓,吴海洋,刘晓光,林娟,叶秀云. 食品与发酵工业. 2017(10)
[4]产甘油假丝酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶编码基因的克隆[J]. 王正祥,诸葛健. 微生物学报. 1999(04)
本文编号：3281290
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