TGF-β3通过Lgl2调节大鼠血睾屏障及睾丸支持细胞乳酸分泌功能的机制研究
发布时间：2021-07-24 11:21
目的:在哺乳动物生精上皮中,睾丸支持细胞（Sertoli细胞）在精子发生过程中发挥着重要作用。相邻Sertoli细胞通过胞间连接形成血睾屏障（BTB）,将生精上皮分隔成与生精小管上皮基膜相近的基底小室和连接生精小管管腔的近腔小室,为精子的形成创造了一个免疫豁免的微环境。在生精上皮周期的VIII期,前细线期精母细胞从基底室向近腔室的迁移涉及精母细胞移行后方新BTB复合体的构建和移行前方原有BTB复合体的分解。由Sertoli细胞和生精细胞分泌的转化生长因子-β3（TGF-β3）已被证实能够通过多种途径引起BTB屏障功能损坏,促进生精细胞迁移,但其调控BTB屏障功能的分子机制尚未被完全阐明。本课题组前期通过基因芯片筛选出TGF-β3作用前后Sertoli细胞中差异表达的microRNAs（miRNAs）,其中miR-142-3p已被证实在多种细胞活动中参与了TGF-β介导的信号转导通路。我们前期通过生物信息学软件预测miR-142-3p能够特异性结合幼虫巨大致死性基因（Lgl）哺乳动物同源物Lgl2,推测miR-142-3p可能通过靶向Lgl2影响TGF-?3诱导的BTB屏障功能损伤。本研...
【文章来源】：中国医科大学辽宁省
【文章页数】：101 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
BTB周期性变化及本研究思路示意图
3.2 miR-142-3p 抑制 TGF-β3 诱导的大鼠原代 Sertoli 细胞屏障功能减退基于 miR-142-3p 在多种 TGF-β3 介导调控的细胞活动中发挥重要作用[19-21]，并在大鼠生精上皮周期中具有与 TGF-β3 相反的表达趋势，我们分析了 miR-142-3p 对TGF-β3 诱导的 Sertoli 细胞屏障功能损伤的影响。我们从 20 天龄 SD 大鼠睾丸中分离提取 Sertoli 细胞，通过原代培养构建体外 BTB 模型，进行 BTB 屏障功能检测。跨上皮电阻（TER）测定及荧光素钠（Na-F）通透率检测结果显示：与对照组相比，TGF-β3（3 ng/ml，24 h）处理组 TER 值降低约 40%（图 3.2A），同时 Na-F 通透率升高约 30%（图 3.2 B），表明 TGF-β3 处理能够诱导 Sertoli 细胞屏障功能减退。而过表达 miR-142-3p 后，经 TGF-β3 处理的 Sertoli 细胞与对照组相比 TER 值及 Na-F通透率均无明显差异（图 3.2），证明 miR-142-3p 过表达能够显著改善 TGF-β3 诱导的 Sertoli 细胞屏障功能减退。A B
中国医科大学博士学位论文子[7]，为了进一步了解 miR-142-3p 拮抗 TGF-β3 诱导的 Sertoli 细胞屏障功能减退的作用机制，我们采用免疫沉淀检测了各组细胞 Cdc42 的活性水平。结果显示：TGF-β3处理对 Cdc42 具有明显的激活作用，即其活性形式 Cdc42-GTP 的水平明显增高；而过表达 miR-142-3p 后，经 TGF-β3 处理的 Sertoli 细胞中 Cdc42-GTP 的水平与对照组相比无明显变化（图 3.3 A、B）。同时，我们检测了各组 Sertoli 细胞中紧密连接蛋白 occludin 的表达水平。免疫印迹及免疫荧光结果均显示：与对照组相比，TGF-β3 处理组 occludin 表达水平显著下降；而过表达 miR-142-3p 后再经 TGF-β3处理的 Sertoli 细胞中，occludin 表达水平与对照组相比无明显变化；并且单独过表达 miR-142-3p 的 Sertoli 细胞中 occludin 表达水平与对照组相比有所升高（图 3.3）。以上结果表明 miR-142-3p 在体外 BTB 模型中能够抑制 TGF-β3 诱导的大鼠原代Sertoli 细胞屏障功能减退。AC
本文编号：3300554
【文章来源】：中国医科大学辽宁省
【文章页数】：101 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
BTB周期性变化及本研究思路示意图
3.2 miR-142-3p 抑制 TGF-β3 诱导的大鼠原代 Sertoli 细胞屏障功能减退基于 miR-142-3p 在多种 TGF-β3 介导调控的细胞活动中发挥重要作用[19-21]，并在大鼠生精上皮周期中具有与 TGF-β3 相反的表达趋势，我们分析了 miR-142-3p 对TGF-β3 诱导的 Sertoli 细胞屏障功能损伤的影响。我们从 20 天龄 SD 大鼠睾丸中分离提取 Sertoli 细胞，通过原代培养构建体外 BTB 模型，进行 BTB 屏障功能检测。跨上皮电阻（TER）测定及荧光素钠（Na-F）通透率检测结果显示：与对照组相比，TGF-β3（3 ng/ml，24 h）处理组 TER 值降低约 40%（图 3.2A），同时 Na-F 通透率升高约 30%（图 3.2 B），表明 TGF-β3 处理能够诱导 Sertoli 细胞屏障功能减退。而过表达 miR-142-3p 后，经 TGF-β3 处理的 Sertoli 细胞与对照组相比 TER 值及 Na-F通透率均无明显差异（图 3.2），证明 miR-142-3p 过表达能够显著改善 TGF-β3 诱导的 Sertoli 细胞屏障功能减退。A B
中国医科大学博士学位论文子[7]，为了进一步了解 miR-142-3p 拮抗 TGF-β3 诱导的 Sertoli 细胞屏障功能减退的作用机制，我们采用免疫沉淀检测了各组细胞 Cdc42 的活性水平。结果显示：TGF-β3处理对 Cdc42 具有明显的激活作用，即其活性形式 Cdc42-GTP 的水平明显增高；而过表达 miR-142-3p 后，经 TGF-β3 处理的 Sertoli 细胞中 Cdc42-GTP 的水平与对照组相比无明显变化（图 3.3 A、B）。同时，我们检测了各组 Sertoli 细胞中紧密连接蛋白 occludin 的表达水平。免疫印迹及免疫荧光结果均显示：与对照组相比，TGF-β3 处理组 occludin 表达水平显著下降；而过表达 miR-142-3p 后再经 TGF-β3处理的 Sertoli 细胞中，occludin 表达水平与对照组相比无明显变化；并且单独过表达 miR-142-3p 的 Sertoli 细胞中 occludin 表达水平与对照组相比有所升高（图 3.3）。以上结果表明 miR-142-3p 在体外 BTB 模型中能够抑制 TGF-β3 诱导的大鼠原代Sertoli 细胞屏障功能减退。AC
本文编号：3300554
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