CRISPR/Cas系统在活细胞染色体成像中的应用
发布时间：2021-07-25 15:47
CRISPR/Cas（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated Proteins）是细菌抵抗外来入侵的一种自适应免疫机制,利用CRISPR/Cas9系统可实现双链DNA的剪切并诱导宿主细胞DNA修复机制,从而达到靶向编辑基因的目的。核酸酶失活的Cas9（Nuclease-deactivated Cas9,d Cas9）耦联效应分子可以调控靶标结合位点附近基因的表达、表观遗传修饰及特异染色体区域标记。目前已开发出多种CRISPR/Cas9系统,可对活细胞中重复或低重复序列基因位点进行实时多位点同步成像,广泛应用于动物和植物细胞中。基于CRISPR/Cas系统的活细胞染色体成像技术为研究活细胞染色体动力学和三维染色体结构提供了全新角度。本研究针对CRISPR/Cas系统的生源机制及其在活细胞成像的应用和发展现状进行概述,以期为该领域的相关研究提供参考。
【文章来源】：天津农业科学. 2020,26(01)
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
CRISPR/Cas9的作用机制
d Cas9与e GFP(enhanced Green FluorescentProtein,eGFP）融合表达后，dCas9-eGFP复合体与sgRNA在细胞内组装成有功能的复合体，待复合体结合到靶标DNA后，可通过荧光显微镜对活细胞中端粒等高重复染色体区域进行动态观察。在非重复基因座上靶向36～73个sgRNA，该系统能够观测到MUC4基因座内的非重复基因组区域。为实现多个gRNA的复用并将数十个不同的g RNAs高效递送到单细胞中，Gu等[14]扩展了dCas9-eGFP成像方法，开发了一种称为嵌合gRNA寡核苷酸阵列（Chimeric Array of g RNA Oligonucleotides,CARGO）的技术。CARGO技术将几十个不同的gRNAs组成阵列递送到单细胞中，从而精确识别独特的非重复DNA片段，再利用多种荧光分子对其进行标记，实现了对特异DNA片段的动态观测。利用该技术，Gu等[14]定量地测定了胚胎干细胞中发生分化相关活性的增强子和启动子的运动变化情况。由于dCas9蛋白倾向定位在核仁中，dCas9-eGFP方法在核仁中会引发较高的背景信号。为了增强荧光信号强度和提升信噪比，可用更多的荧光蛋白（Fluorescent Protein,FP）分子标记dCas9，例如通过使用超新星标记系统（Sun-Tag），即利用一般对照不可诱导4号（General Control Non-Inducible 4,GCN4）肽序列与特异纳米抗体之间相互作用募集多个FP[15]。利用dCas9-SunTag可以实现仅用20种不同的sgRNA就能连续跟踪MUC4基因的非重复区域[16-17]。
荧光原位杂交（Fluorescencein Situ Fybridization,FISH）技术是利用与荧光基团耦合的核苷酸作为探针，在细胞内与相应的靶DNA或RNA分子杂交，通过在荧光显微镜下观察荧光信号而对组织、细胞或染色体上DNA或RNA进行定性或定位分析的一种技术[20]（图3）。FISH迄今已发展了30多年，其在识别DNA和RNA序列方面具有高度敏感性和特异性，并且能在单细胞水平上同时对多个染色体位点进行可视化追踪[21]，因此在解决单个染色体或整个基因组的结构、突变和进化等有关方面得到了广泛应用[22]。但由于DNA FISH需要经过甲酰胺和热处理使DNA变性以便于与荧光核酸探针进行杂交，该过程可能会对生物体结构和基因组织的完整性造成破坏，无法准确的反映其原有空间结构[23]。CASFISH(Cas9-mediated FISH）利用CRISPR/Cas9复合物具有识别特异靶DNA的特性来标记序列特异性的染色体位点[24],DNA不需要经过变性处理，有利于保留细胞形态和基因组结构。CASFISH既可对含有高重复序列的染色体位点进行标记，也可通过使用多个sgRNA将Cas9-荧光蛋白复合物靶向目标位点，从而标记非重复染色体位点。不同荧光标记的d Cas9/sgRNA还可对细胞中的多个染色体位点进行同步多色标记，以便于研究多个染色体位点之间的空间关系。由于CASFISH是利用dCas9介导的酶促反应对特定序列进行标记，在优化条件下15 min内即可完成标记，相对DNA FISH方法更加快捷[24]。将d Cas9与Halo标签融合，形成的dCas-Halo可用于各种荧光染料标记[24-25]，再利用靶向不同DNA序列的sgRNA组合，可增加荧光染料选用的灵活性和多样性，并降低开发靶向多重基因位点荧光探针的成本。Takei等[26]和Guan等[27]提出了一种先跟踪后识别（Track First and Identify Later）的策略，即将CRISPR/dCas系统和DNA Sequential FISH(seqFISH）相结合的方法来对活细胞内的多个染色体位点进行动态追踪（图4）。首先用CRISPR/dCas9系统对多个染色体位点进行单色实时成像。当动态记录结束时再将细胞固定，连续多次使用DNA FISH来识别每个位点的身份。这一方法将染色体位点的动态追踪任务和这些位点的独特识别分离，将CRISPR标记和seqFISH两者优势相结合，实现了在单一颜色通道下对活细胞的多个染色体位点的动态追踪。为了能够在实时成像之后快速且连续的进行DNA FISH操作，Guan等[27]优化了FISH方法，使得整个染色过程能在1 min内完成，极大地缩短了试验周期。每轮成像检测后利用甲酰胺溶液洗涤以去除上一轮结合的DNA探针，避免连续多次FISH试验中DNA探针信号之间的干扰。利用该方法可同时对7个染色体位点进行鉴定，DNA FISH经过20多轮的染色和洗涤后，仍能保持高强度的荧光信号和高效率的清洗效果[27]。这种将实时和固定成像联合使用的方法同样可用于RNA-FISH中对多个靶标RNA成像。
【参考文献】：
期刊论文
[1]Progress and Challenges for Live-cell Imaging of Genomic Loci Using CRISPR-based Platforms[J]. Xiaotian Wu,Shiqi Mao,Yachen Ying,Christopher J.Krueger,Antony K.Chen. Genomics,Proteomics & Bioinformatics. 2019(02)
本文编号：3302315
【文章来源】：天津农业科学. 2020,26(01)
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
CRISPR/Cas9的作用机制
d Cas9与e GFP(enhanced Green FluorescentProtein,eGFP）融合表达后，dCas9-eGFP复合体与sgRNA在细胞内组装成有功能的复合体，待复合体结合到靶标DNA后，可通过荧光显微镜对活细胞中端粒等高重复染色体区域进行动态观察。在非重复基因座上靶向36～73个sgRNA，该系统能够观测到MUC4基因座内的非重复基因组区域。为实现多个gRNA的复用并将数十个不同的g RNAs高效递送到单细胞中，Gu等[14]扩展了dCas9-eGFP成像方法，开发了一种称为嵌合gRNA寡核苷酸阵列（Chimeric Array of g RNA Oligonucleotides,CARGO）的技术。CARGO技术将几十个不同的gRNAs组成阵列递送到单细胞中，从而精确识别独特的非重复DNA片段，再利用多种荧光分子对其进行标记，实现了对特异DNA片段的动态观测。利用该技术，Gu等[14]定量地测定了胚胎干细胞中发生分化相关活性的增强子和启动子的运动变化情况。由于dCas9蛋白倾向定位在核仁中，dCas9-eGFP方法在核仁中会引发较高的背景信号。为了增强荧光信号强度和提升信噪比，可用更多的荧光蛋白（Fluorescent Protein,FP）分子标记dCas9，例如通过使用超新星标记系统（Sun-Tag），即利用一般对照不可诱导4号（General Control Non-Inducible 4,GCN4）肽序列与特异纳米抗体之间相互作用募集多个FP[15]。利用dCas9-SunTag可以实现仅用20种不同的sgRNA就能连续跟踪MUC4基因的非重复区域[16-17]。
荧光原位杂交（Fluorescencein Situ Fybridization,FISH）技术是利用与荧光基团耦合的核苷酸作为探针，在细胞内与相应的靶DNA或RNA分子杂交，通过在荧光显微镜下观察荧光信号而对组织、细胞或染色体上DNA或RNA进行定性或定位分析的一种技术[20]（图3）。FISH迄今已发展了30多年，其在识别DNA和RNA序列方面具有高度敏感性和特异性，并且能在单细胞水平上同时对多个染色体位点进行可视化追踪[21]，因此在解决单个染色体或整个基因组的结构、突变和进化等有关方面得到了广泛应用[22]。但由于DNA FISH需要经过甲酰胺和热处理使DNA变性以便于与荧光核酸探针进行杂交，该过程可能会对生物体结构和基因组织的完整性造成破坏，无法准确的反映其原有空间结构[23]。CASFISH(Cas9-mediated FISH）利用CRISPR/Cas9复合物具有识别特异靶DNA的特性来标记序列特异性的染色体位点[24],DNA不需要经过变性处理，有利于保留细胞形态和基因组结构。CASFISH既可对含有高重复序列的染色体位点进行标记，也可通过使用多个sgRNA将Cas9-荧光蛋白复合物靶向目标位点，从而标记非重复染色体位点。不同荧光标记的d Cas9/sgRNA还可对细胞中的多个染色体位点进行同步多色标记，以便于研究多个染色体位点之间的空间关系。由于CASFISH是利用dCas9介导的酶促反应对特定序列进行标记，在优化条件下15 min内即可完成标记，相对DNA FISH方法更加快捷[24]。将d Cas9与Halo标签融合，形成的dCas-Halo可用于各种荧光染料标记[24-25]，再利用靶向不同DNA序列的sgRNA组合，可增加荧光染料选用的灵活性和多样性，并降低开发靶向多重基因位点荧光探针的成本。Takei等[26]和Guan等[27]提出了一种先跟踪后识别（Track First and Identify Later）的策略，即将CRISPR/dCas系统和DNA Sequential FISH(seqFISH）相结合的方法来对活细胞内的多个染色体位点进行动态追踪（图4）。首先用CRISPR/dCas9系统对多个染色体位点进行单色实时成像。当动态记录结束时再将细胞固定，连续多次使用DNA FISH来识别每个位点的身份。这一方法将染色体位点的动态追踪任务和这些位点的独特识别分离，将CRISPR标记和seqFISH两者优势相结合，实现了在单一颜色通道下对活细胞的多个染色体位点的动态追踪。为了能够在实时成像之后快速且连续的进行DNA FISH操作，Guan等[27]优化了FISH方法，使得整个染色过程能在1 min内完成，极大地缩短了试验周期。每轮成像检测后利用甲酰胺溶液洗涤以去除上一轮结合的DNA探针，避免连续多次FISH试验中DNA探针信号之间的干扰。利用该方法可同时对7个染色体位点进行鉴定，DNA FISH经过20多轮的染色和洗涤后，仍能保持高强度的荧光信号和高效率的清洗效果[27]。这种将实时和固定成像联合使用的方法同样可用于RNA-FISH中对多个靶标RNA成像。
【参考文献】：
期刊论文
[1]Progress and Challenges for Live-cell Imaging of Genomic Loci Using CRISPR-based Platforms[J]. Xiaotian Wu,Shiqi Mao,Yachen Ying,Christopher J.Krueger,Antony K.Chen. Genomics,Proteomics & Bioinformatics. 2019(02)
本文编号：3302315
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3302315.html
