植物蛋白SUMO化修饰检测方法
发布时间：2021-08-19 20:50
SUMO化是一种重要的蛋白质翻译后修饰,对植物正常生长发育不可或缺。到目前为止已筛选到上千个可能的SUMO底物,但由于SUMO化修饰水平普遍很低,其生物学功能研究相对较少。该文详细描述了检测蛋白SUMO化修饰的常用方法,包括体外和体内SUMO化实验,以及SUMO化修饰位点的检测方法,旨在为深入研究植物蛋白SUMO化修饰提供技术支持。
【文章来源】：植物学报. 2020,55(01)北大核心CSCD
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
Protein X体外SUMO化修饰
(5)Western blot检测用30μL 2×SDS上样缓冲液重悬beads,100°C煮沸5分钟,瞬时离心,混匀。1 000×g离心3分钟,上样。Western blot,anti-FLAG抗体仅在实验组(FLAG-SUMO1GG)检测到目的条带上方间隔×15 kDa(FLAG-SUMO1大约15 kDa)处有1条或多条条带,说明目的蛋白在烟草中能够被SUMO化修饰。如图2所示,只有与FLAG-SUMO1GG共表达时,anti-FLAG抗体才能够检测到SUMO化修饰的GFP-protein X,说明GFP-protein X是SUMO底物。5.2.2 拟南芥原生质体中检测SUMO化修饰方法
SUMO底物通常含有保守的ΨKXD/E序列,其中Ψ代表疏水性氨基酸,K是SUMO分子共价结合的赖氨酸,X为任意氨基酸,D/E为酸性氨基酸(天冬氨酸(D)或谷氨酸(E))。SUMO结合酶E2可识别ΨKXD/E基序,介导底物SUMO化修饰(Bernier-Villamor et al.,2002)。常用的SUMO化修饰分析软件有GPS-SUMO(Zhaoet al.,2014)、SUMOplot(http://www.abgent.com/umoplot)以及JASSA(http://www.jassa.fr/index.hp?jassa)。但由于SUMO化修饰位点并非均是保守的ΨKXD/E基序,故还需要结合质谱检测进行分析。为提高质谱检测效率,通常使用SUMO1H89R检测底物的SUMO化修饰位点(Miller et al.,2010)。通过软件分析和质谱检测获得可能的SUMO化修饰结合位点,然后通过SUMO化实验进行验证。目前,判断SUMO化修饰结合位点的主要依据是SUMO结合位点赖氨酸(K)突变成精氨酸(R)能抑制底物SUMO化修饰(Bernier-Villamor et al.,2002)。如图4所示,Myc-protein X和FLAG-SUMO1GG在烟草中共表达,IP(anti-Myc)产物用anti-FALG抗体能检测到SUMO化修饰的Myc-protein X,说明protein X是SUMO底物。当把protein X两个可能的SUMO化修饰结合位点K1和K2单独突变后,仍能检测到SUMO化修饰条带,但2个位点同时突变(2KR)后,几乎检测不到,说明K1和K2是protein X主要的SUMO化修饰结合位点。
【参考文献】：
期刊论文
[1]Arabidopsis SUMO protease ASP1 positively regulates flowering time partially through regulating FLC stability[J]. Xiangxiong Kong,Xi Luo,Gao-Ping Qu,Peng Liu,Jing Bo Jin. Journal of Integrative Plant Biology. 2017(01)
[2]植物SUMO化修饰及其生物学功能[J]. 徐庞连,曾棉炜,黄丽霞,阳成伟. 植物学通报. 2008(05)
本文编号：3352122
【文章来源】：植物学报. 2020,55(01)北大核心CSCD
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
Protein X体外SUMO化修饰
(5)Western blot检测用30μL 2×SDS上样缓冲液重悬beads,100°C煮沸5分钟,瞬时离心,混匀。1 000×g离心3分钟,上样。Western blot,anti-FLAG抗体仅在实验组(FLAG-SUMO1GG)检测到目的条带上方间隔×15 kDa(FLAG-SUMO1大约15 kDa)处有1条或多条条带,说明目的蛋白在烟草中能够被SUMO化修饰。如图2所示,只有与FLAG-SUMO1GG共表达时,anti-FLAG抗体才能够检测到SUMO化修饰的GFP-protein X,说明GFP-protein X是SUMO底物。5.2.2 拟南芥原生质体中检测SUMO化修饰方法
SUMO底物通常含有保守的ΨKXD/E序列,其中Ψ代表疏水性氨基酸,K是SUMO分子共价结合的赖氨酸,X为任意氨基酸,D/E为酸性氨基酸(天冬氨酸(D)或谷氨酸(E))。SUMO结合酶E2可识别ΨKXD/E基序,介导底物SUMO化修饰(Bernier-Villamor et al.,2002)。常用的SUMO化修饰分析软件有GPS-SUMO(Zhaoet al.,2014)、SUMOplot(http://www.abgent.com/umoplot)以及JASSA(http://www.jassa.fr/index.hp?jassa)。但由于SUMO化修饰位点并非均是保守的ΨKXD/E基序,故还需要结合质谱检测进行分析。为提高质谱检测效率,通常使用SUMO1H89R检测底物的SUMO化修饰位点(Miller et al.,2010)。通过软件分析和质谱检测获得可能的SUMO化修饰结合位点,然后通过SUMO化实验进行验证。目前,判断SUMO化修饰结合位点的主要依据是SUMO结合位点赖氨酸(K)突变成精氨酸(R)能抑制底物SUMO化修饰(Bernier-Villamor et al.,2002)。如图4所示,Myc-protein X和FLAG-SUMO1GG在烟草中共表达,IP(anti-Myc)产物用anti-FALG抗体能检测到SUMO化修饰的Myc-protein X,说明protein X是SUMO底物。当把protein X两个可能的SUMO化修饰结合位点K1和K2单独突变后,仍能检测到SUMO化修饰条带,但2个位点同时突变(2KR)后,几乎检测不到,说明K1和K2是protein X主要的SUMO化修饰结合位点。
【参考文献】：
期刊论文
[1]Arabidopsis SUMO protease ASP1 positively regulates flowering time partially through regulating FLC stability[J]. Xiangxiong Kong,Xi Luo,Gao-Ping Qu,Peng Liu,Jing Bo Jin. Journal of Integrative Plant Biology. 2017(01)
[2]植物SUMO化修饰及其生物学功能[J]. 徐庞连,曾棉炜,黄丽霞,阳成伟. 植物学通报. 2008(05)
本文编号：3352122
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3352122.html
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