猪δ冠状病毒西安野毒株的分离鉴定及其M蛋白的免疫原性研究
发布时间：2021-08-23 19:02
猪δ冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV）是一种新发现的肠道冠状病毒,能引起新生仔猪腹泻、呕吐、脱水、死亡,致死率能达到30%～40%,严重降低了新生仔猪的存活率,影响了养猪业的发展。在我国已经有多个省份分离了PDCoV地方株,但至今未见PDCoV陕西地方株分离的报道。成功分离PDCoV地方株对陕西地区PDCoV发病机制研究、病毒学和血清学分析以及疫苗开发具有重要意义。表达PDCoV的结构蛋白为后续开发诊断试剂和潜在的PDCoV亚单位疫苗提供了基础。本试验采集陕西省西安某猪场腹泻仔猪的肠道及内容物,利用猪睾丸（ST）细胞进行病原分离,细胞出现明显病变时,利用RT-PCR方法扩增PDCoV西安株M全基因序列并测序,探究其B细胞表位是否发生改变。将M基因与表达载体p ET-32a构建重组质粒,转入到BL21（DE3）菌株诱导表达,以纯化的重组蛋白免疫小鼠制得多克隆抗体。本研究取得如下结果:1. PDCoV分离株盲传5代,感染ST细胞72 h后出现细胞病变,主要表现为细胞变圆、变大、聚集和脱落。RT-PCR检测显示PDCoV阳性,命名为CHN-XA18-35...
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：57 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
引起猪病毒性疾病的六种冠状病毒Figure1-1Sixcoronavirusesthatcauseviraldiseasesinswine
肠组织病变及免疫组化染色（Chenetal.2015）
西北农林科技大学硕士学位论文142.3.1PDCoV分离的结果PDCoV盲传5代，感染ST细胞48h后出现轻微细胞病变，主要表现为细胞变圆，细胞界限变得不清晰；接毒72h后，细胞病变更为明显，主要表现为细胞变圆、变大、聚集和脱落（图2-1）。RT-PCR法检测病毒培养物发现，从西安分离的毒株成PDCoV阳性，命名为CHN-XA18-35株。图2-1PDCoV引起ST细胞特征性病变（100×）Figure2-1ThecharacteristicpathogenicityofSTcellsafterinfectedbyPDCoV(100×)A.ST细胞正常形态；B.PDCoV感染ST细胞48h后的病变；C.PDCoV感染ST细胞72h后的病变A.STcellsnormalmorphology;B.Cytopathiceffectafter48hoursofPDCoVinfection;C.Cytopathiceffectafter72hoursofPDCoVinfection2.3.2TCID50计算结果连续观察一周，待半数细胞孔发生细胞病变，按照Reed-munch法计算TCID50，记录的出现细胞病变结果见表2-3。表2-3猪δ冠状病毒TCID50的观察记录结果Table2-3TheTCID50resultsofPDCoV稀释度Dilutionration接种细胞孔Inoculationcellwells无病变孔数Numberofnon-CPEwells有病变孔数NumberofCPEwells无病变孔数累积Totalnumberofnon-CPEwells有病变孔数累积TotalnumberofCPEwells细胞病变比例Cytopathicratio出现细胞病变率(%)Cytopathicrate(%)10-180804343/4310010-280803535/3510010-380802727/2710010-480801919/1910010-582621111/1384.610-6853755/1241.7
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪丁型冠状病毒CH/GX/1468B/2017的分离鉴定及全基因组序列分析[J]. 秦毅斌,何苹萍,卢冰霞,何颖,梁家幸,刘磊,段群棚,韦嫔媛,李斌,陈忠伟,周英宁,苏乾莲,蒋冬福,卢敬专,赵武. 中国畜牧兽医. 2019(07)
[2]猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化及鉴定[J]. 王席,李国攀,陈清清,徐保娟,荣俊. 中国畜牧兽医. 2019(06)
[3]PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用[J]. 施开创,王睿敏,黎宗强,谢守玉,尹彦文,陆文俊,屈素洁. 中国预防兽医学报. 2019(06)
[4]猪δ冠状病毒N蛋白的原核表达和间接ELISA检测方法的建立[J]. 闫瑞杰,张云飞,刘玲玲,张红垒,王亚宾,胡慧. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2019(10)
[5]PEDV分离株S1基因的重组杆状病毒真核表达[J]. 何海健,吴瑗,王鲁彦,李群景,巴少波,石林,邵春艳,孙静,姜胜,王晓杜. 中国畜牧兽医. 2019(03)
[6]猪δ冠状病毒M蛋白的原核表达、纯化与鉴定[J]. 魏姗,石达,陈建飞,冯力,孙东波. 黑龙江八一农垦大学学报. 2018(05)
[7]猪流行性腹泻病毒E基因真核表达载体的构建及融合蛋白的表达[J]. 郑亮,邹德华,程丽鑫,李兴志,张雅婷,沈玉江,武雪宁,徐嘉欣,王显赫,张华,曹宏伟. 黑龙江八一农垦大学学报. 2018(04)
[8]2种猪冠状病毒双重RT-PCR检测方法的建立与应用[J]. 温海京,贾超伟,刘芊麟,张喜喜,刘鑫宇,周双海. 北京农学院学报. 2019(01)
[9]猪丁型冠状病毒S1基因的克隆、原核表达及多克隆抗体制备[J]. 李成,张雨迪,黄小波,刘浩宇,刘志鹏,赵玉佳,曹三杰,文心田,文翼平,赵勤,伍锐. 畜牧兽医学报. 2018(06)
[10]猪丁型冠状病毒的分离鉴定与基因分析[J]. 刘怀东,孙淼,赵炜,薛青红,魏春霞,才学鹏,陈瑞,刘灿,孙晓林. 中国兽药杂志. 2018(05)
硕士论文
[1]猪δ冠状病毒的分离、鉴定及荧光定量PCR检测方法的建立[D]. 肖帅.甘肃农业大学 2018
[2]猪丁型冠状病毒HB-BD株分离鉴定及生物学特性研究[D]. 刘宝京.河北农业大学 2018
[3]猪δ冠状病毒江西分离株CH/JX/JGS/01的细胞培养特性与遗传进化分析[D]. 张敏.江西农业大学 2018
[4]猪δ冠状病毒RT-PCR、RT-LAMP及间接ELISA检测方法的建立及应用[D]. 张帆帆.江西农业大学 2017
[5]猪丁型冠状病毒检测方法的建立及JS-LYG-2014毒株的分离与鉴定[D]. 逄凤娇.南京农业大学 2017
本文编号：3358421
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：57 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
引起猪病毒性疾病的六种冠状病毒Figure1-1Sixcoronavirusesthatcauseviraldiseasesinswine
肠组织病变及免疫组化染色（Chenetal.2015）
西北农林科技大学硕士学位论文142.3.1PDCoV分离的结果PDCoV盲传5代，感染ST细胞48h后出现轻微细胞病变，主要表现为细胞变圆，细胞界限变得不清晰；接毒72h后，细胞病变更为明显，主要表现为细胞变圆、变大、聚集和脱落（图2-1）。RT-PCR法检测病毒培养物发现，从西安分离的毒株成PDCoV阳性，命名为CHN-XA18-35株。图2-1PDCoV引起ST细胞特征性病变（100×）Figure2-1ThecharacteristicpathogenicityofSTcellsafterinfectedbyPDCoV(100×)A.ST细胞正常形态；B.PDCoV感染ST细胞48h后的病变；C.PDCoV感染ST细胞72h后的病变A.STcellsnormalmorphology;B.Cytopathiceffectafter48hoursofPDCoVinfection;C.Cytopathiceffectafter72hoursofPDCoVinfection2.3.2TCID50计算结果连续观察一周，待半数细胞孔发生细胞病变，按照Reed-munch法计算TCID50，记录的出现细胞病变结果见表2-3。表2-3猪δ冠状病毒TCID50的观察记录结果Table2-3TheTCID50resultsofPDCoV稀释度Dilutionration接种细胞孔Inoculationcellwells无病变孔数Numberofnon-CPEwells有病变孔数NumberofCPEwells无病变孔数累积Totalnumberofnon-CPEwells有病变孔数累积TotalnumberofCPEwells细胞病变比例Cytopathicratio出现细胞病变率(%)Cytopathicrate(%)10-180804343/4310010-280803535/3510010-380802727/2710010-480801919/1910010-582621111/1384.610-6853755/1241.7
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪丁型冠状病毒CH/GX/1468B/2017的分离鉴定及全基因组序列分析[J]. 秦毅斌,何苹萍,卢冰霞,何颖,梁家幸,刘磊,段群棚,韦嫔媛,李斌,陈忠伟,周英宁,苏乾莲,蒋冬福,卢敬专,赵武. 中国畜牧兽医. 2019(07)
[2]猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化及鉴定[J]. 王席,李国攀,陈清清,徐保娟,荣俊. 中国畜牧兽医. 2019(06)
[3]PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用[J]. 施开创,王睿敏,黎宗强,谢守玉,尹彦文,陆文俊,屈素洁. 中国预防兽医学报. 2019(06)
[4]猪δ冠状病毒N蛋白的原核表达和间接ELISA检测方法的建立[J]. 闫瑞杰,张云飞,刘玲玲,张红垒,王亚宾,胡慧. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2019(10)
[5]PEDV分离株S1基因的重组杆状病毒真核表达[J]. 何海健,吴瑗,王鲁彦,李群景,巴少波,石林,邵春艳,孙静,姜胜,王晓杜. 中国畜牧兽医. 2019(03)
[6]猪δ冠状病毒M蛋白的原核表达、纯化与鉴定[J]. 魏姗,石达,陈建飞,冯力,孙东波. 黑龙江八一农垦大学学报. 2018(05)
[7]猪流行性腹泻病毒E基因真核表达载体的构建及融合蛋白的表达[J]. 郑亮,邹德华,程丽鑫,李兴志,张雅婷,沈玉江,武雪宁,徐嘉欣,王显赫,张华,曹宏伟. 黑龙江八一农垦大学学报. 2018(04)
[8]2种猪冠状病毒双重RT-PCR检测方法的建立与应用[J]. 温海京,贾超伟,刘芊麟,张喜喜,刘鑫宇,周双海. 北京农学院学报. 2019(01)
[9]猪丁型冠状病毒S1基因的克隆、原核表达及多克隆抗体制备[J]. 李成,张雨迪,黄小波,刘浩宇,刘志鹏,赵玉佳,曹三杰,文心田,文翼平,赵勤,伍锐. 畜牧兽医学报. 2018(06)
[10]猪丁型冠状病毒的分离鉴定与基因分析[J]. 刘怀东,孙淼,赵炜,薛青红,魏春霞,才学鹏,陈瑞,刘灿,孙晓林. 中国兽药杂志. 2018(05)
硕士论文
[1]猪δ冠状病毒的分离、鉴定及荧光定量PCR检测方法的建立[D]. 肖帅.甘肃农业大学 2018
[2]猪丁型冠状病毒HB-BD株分离鉴定及生物学特性研究[D]. 刘宝京.河北农业大学 2018
[3]猪δ冠状病毒江西分离株CH/JX/JGS/01的细胞培养特性与遗传进化分析[D]. 张敏.江西农业大学 2018
[4]猪δ冠状病毒RT-PCR、RT-LAMP及间接ELISA检测方法的建立及应用[D]. 张帆帆.江西农业大学 2017
[5]猪丁型冠状病毒检测方法的建立及JS-LYG-2014毒株的分离与鉴定[D]. 逄凤娇.南京农业大学 2017
本文编号：3358421
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