miR-107在柯萨奇B3病毒复制过程中的调控作用
发布时间：2021-08-24 16:40
目的:通过研究miR-107在CVB3感染Hela细胞过程中的表达差异,探索其对CVB3复制的调控作用及机制,旨为CVB3感染相关疾病的临床诊断提供新的理论依据和新型生物标志物。方法:1.筛选出CVB3感染相关的miRNA;采用RT-qPCR方法确定miR-107的差异表达情况。2.在Hela细胞中过表达或沉默miR-107后感染CVB3,通过RT-qPCR方法检测转染效率,并收集感染至6h的总蛋白;Western blot检测病毒衣壳蛋白VP1的表达,分析miR-107对CVB3复制增殖的影响;收集上清液进行病毒蚀斑实验,分析miR-107对CVB3释放的影响。3.通过TargetScan和miRTarBase数据库筛选出miR-107的靶基因KLF4和BACE1,采用荧光素酶报告载体实验进行靶点验证。4.Hela细胞过表达或沉默靶基因后感染CVB3并收集感染6h的总RNA和总蛋白,RT-qPCR和Western blot分析靶基因的表达变化,以及靶基因对CVB3复制增殖的影响;同时收集上清液进行病毒蚀斑实验,分析靶基因对病毒CVB3释放的影响。5.Hela细胞内转染miR-107的...
【文章来源】：江苏大学江苏省
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
技术路线图
江苏大学硕士学位论文15上孵育1h后洗涤，1×TBS/TBuffer洗膜3次，每次洗涤20min。（8）显色与分析：将在南京诺唯赞生物科技有限公司购买的HRP-ECL曝光液的A、B液按照等比例混合，滴加于PVDF膜的蛋白面后使用化学发光成像系统拍照分析、留存图像，便于后续分析统计结果。2.2.7结果统计与数据处理本实验结果使用ImagineJ软件进行灰度扫描，采用GraphPadPrism7软件进行统计学分析，数据以X±SD表示，组间差异比较采用双侧T检验，P<0.05为具有统计学意义。2.3实验结果2.3.1CVB3在Hela细胞内的复制情况由Westernblot实验结果可见，Hela细胞感染CVB34h后，VP1蛋白的表达可被实验检出，在6h、8h表达水平显著升高，依据实验结果且避免临界效应，我们后续将选择中间时间点6h进行实验（图2.1）（**P<0.01，***P<0.001）。图2.1CVB3在hela细胞中的复制情况A.Hela细胞中CVB3感染不同时间点VP1的表达情况B.VP1灰度扫描Fig2.1CVB3replicationinhelacellsA.ExpressionofVP1atdifferenttimepointsinCVB3infectedHelaB.VP1grayscalescanresults2.3.2CVB3对miR-107表达的影响当六孔板内细胞融合度达到80-90%时，实验组每孔加入10MOICVB3感染细胞，分别收取2h、4h、6h和未感染的Hela细胞，提取细胞总RNA，进行荧光定量PCR（RT-qPCR)实验，以U6作为内参基因，检测CVB3感染后miR-107表达量的变化。由RT-qPCR实验结果可见，Hela细胞感染CVB3后，miR-107的表达呈现逐步上升的趋势，在6h表达水平显著升高，且有统计学意义（**P<0.01）。
miR-107在柯萨奇B3病毒复制过程中的调控作用16图2.2Hela细胞感染CVB3后不同时间点miR-107的表达情况Fig2.2ExpressionofmiR-107atdifferenttimepointsinCVB3infectedHela2.3.3miR-107对CVB3复制增殖的影响为了探讨miR-107对CVB3复制增殖的影响，我们采用脂质体瞬时转染技术，在Hela细胞内过表达或敲减miR-107。通过RT-qPCR实验确定转染效果后（图2.3），由Westernblot实验检测发现：miR-107过表达时，CVB3衣壳蛋白VP1的表达升高（图2.4）。与之相反的是，敲减miR-107抑制了VP1的表达（图2.5）（*P<0.05,***P<0.001,****P<0.0001）。图2.3RT-qPCR检测miR-107过表达和敲减效率A.RT-qPCR检测mimics-107的转染效率B.RT-qPCR检测107-inhibitor的转染效率Fig2.3RT-qPCRtodetecttheefficiencyofmimics-107and107-inhibitorA.RT-qPCRtodetectthetransfectionefficiencyofmimics-107B.RT-qPCRtodetectthetransfectionefficiencyof107-inhibitor
【参考文献】：
期刊论文
[1]汉黄芩苷对柯萨奇B3病毒诱导的病毒性心肌炎小鼠炎症反应的影响[J]. 石哲玮,刘胜新,詹嘉琛,金佳丽,陈莹莹,秦铖璠,钱彩珍. 中国病理生理杂志. 2020(03)
[2]LncRNA TUG1通过调控miR-196b-5p调控卵巢癌细胞凋亡和放射敏感性分子作用机制[J]. 赵国立,张海金,陈鉴. 中国妇幼保健. 2020(04)
[3]Resolvin D2通过抑制NF-κB通路减轻病毒性心肌炎小鼠炎症反应的研究[J]. 石哲玮,刘胜新,张银宇,丁可军,秦铖璠,陈莹莹,钱彩珍. 心电与循环. 2020(01)
[4]LncRNA HEIH通过miR-98-5p调节肺癌细胞增殖和凋亡[J]. 蒋庆锋,于永魁,程金华,申思宁,邢文群. 基础医学与临床. 2020(01)
[5]长链非编码RNA在鼻咽癌中的研究进展[J]. 刘秋燕,熊伟,李程,王巧丽. 中国医药. 2020(01)
[6]lncRNA在乙脑病毒感染PK15细胞过程中的作用研究[J]. 杜程涛,汪涵,杨松柏,李向臣,周晓龙,赵阿勇. 中国畜牧兽医. 2019(07)
[7]LncRNA-NONMMUT131476.1对PHEV复制的影响及其靶基因Nlrc5的验证[J]. 姜景夫,兰云刚,李姿,张竞,关继羽,赵魁,高丰,贺文琦,宋德光. 中国兽医学报. 2019(04)
[8]NF-κB亚基泛素化研究进展[J]. 孙婷,陈泉,肖继,王德明. 生理科学进展. 2018(03)
[9]藻酸双脂钠抑制巨细胞病毒诱导小鼠β分泌酶表达的研究（英文）[J]. 杜宇,李娇,孙延龙,陈永,李文通,阮极盟,张曼,刘志军. 中国海洋药物. 2017(06)
[10]莱菔硫烷对鼻咽癌细胞中Klf4表达及侵袭迁移能力的影响[J]. 李锡清,赵尊兰,刘冬玲,刘明月,马宁,周云. 中华实用诊断与治疗杂志. 2017(08)
博士论文
[1]长链非编码RNA SPRY4-IT1作为miR-101-3p分子海绵上调EZH2的表达促进膀胱癌的增殖和转移[D]. 刘东.华中科技大学 2017
硕士论文
[1]长链非编码RNA HCP5通过微小RNA的吸附作用促进甲状腺滤泡癌的进程[D]. 梁磊磊.大连医科大学 2018
本文编号：3360348
【文章来源】：江苏大学江苏省
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
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江苏大学硕士学位论文15上孵育1h后洗涤，1×TBS/TBuffer洗膜3次，每次洗涤20min。（8）显色与分析：将在南京诺唯赞生物科技有限公司购买的HRP-ECL曝光液的A、B液按照等比例混合，滴加于PVDF膜的蛋白面后使用化学发光成像系统拍照分析、留存图像，便于后续分析统计结果。2.2.7结果统计与数据处理本实验结果使用ImagineJ软件进行灰度扫描，采用GraphPadPrism7软件进行统计学分析，数据以X±SD表示，组间差异比较采用双侧T检验，P<0.05为具有统计学意义。2.3实验结果2.3.1CVB3在Hela细胞内的复制情况由Westernblot实验结果可见，Hela细胞感染CVB34h后，VP1蛋白的表达可被实验检出，在6h、8h表达水平显著升高，依据实验结果且避免临界效应，我们后续将选择中间时间点6h进行实验（图2.1）（**P<0.01，***P<0.001）。图2.1CVB3在hela细胞中的复制情况A.Hela细胞中CVB3感染不同时间点VP1的表达情况B.VP1灰度扫描Fig2.1CVB3replicationinhelacellsA.ExpressionofVP1atdifferenttimepointsinCVB3infectedHelaB.VP1grayscalescanresults2.3.2CVB3对miR-107表达的影响当六孔板内细胞融合度达到80-90%时，实验组每孔加入10MOICVB3感染细胞，分别收取2h、4h、6h和未感染的Hela细胞，提取细胞总RNA，进行荧光定量PCR（RT-qPCR)实验，以U6作为内参基因，检测CVB3感染后miR-107表达量的变化。由RT-qPCR实验结果可见，Hela细胞感染CVB3后，miR-107的表达呈现逐步上升的趋势，在6h表达水平显著升高，且有统计学意义（**P<0.01）。
miR-107在柯萨奇B3病毒复制过程中的调控作用16图2.2Hela细胞感染CVB3后不同时间点miR-107的表达情况Fig2.2ExpressionofmiR-107atdifferenttimepointsinCVB3infectedHela2.3.3miR-107对CVB3复制增殖的影响为了探讨miR-107对CVB3复制增殖的影响，我们采用脂质体瞬时转染技术，在Hela细胞内过表达或敲减miR-107。通过RT-qPCR实验确定转染效果后（图2.3），由Westernblot实验检测发现：miR-107过表达时，CVB3衣壳蛋白VP1的表达升高（图2.4）。与之相反的是，敲减miR-107抑制了VP1的表达（图2.5）（*P<0.05,***P<0.001,****P<0.0001）。图2.3RT-qPCR检测miR-107过表达和敲减效率A.RT-qPCR检测mimics-107的转染效率B.RT-qPCR检测107-inhibitor的转染效率Fig2.3RT-qPCRtodetecttheefficiencyofmimics-107and107-inhibitorA.RT-qPCRtodetectthetransfectionefficiencyofmimics-107B.RT-qPCRtodetectthetransfectionefficiencyof107-inhibitor
【参考文献】：
期刊论文
[1]汉黄芩苷对柯萨奇B3病毒诱导的病毒性心肌炎小鼠炎症反应的影响[J]. 石哲玮,刘胜新,詹嘉琛,金佳丽,陈莹莹,秦铖璠,钱彩珍. 中国病理生理杂志. 2020(03)
[2]LncRNA TUG1通过调控miR-196b-5p调控卵巢癌细胞凋亡和放射敏感性分子作用机制[J]. 赵国立,张海金,陈鉴. 中国妇幼保健. 2020(04)
[3]Resolvin D2通过抑制NF-κB通路减轻病毒性心肌炎小鼠炎症反应的研究[J]. 石哲玮,刘胜新,张银宇,丁可军,秦铖璠,陈莹莹,钱彩珍. 心电与循环. 2020(01)
[4]LncRNA HEIH通过miR-98-5p调节肺癌细胞增殖和凋亡[J]. 蒋庆锋,于永魁,程金华,申思宁,邢文群. 基础医学与临床. 2020(01)
[5]长链非编码RNA在鼻咽癌中的研究进展[J]. 刘秋燕,熊伟,李程,王巧丽. 中国医药. 2020(01)
[6]lncRNA在乙脑病毒感染PK15细胞过程中的作用研究[J]. 杜程涛,汪涵,杨松柏,李向臣,周晓龙,赵阿勇. 中国畜牧兽医. 2019(07)
[7]LncRNA-NONMMUT131476.1对PHEV复制的影响及其靶基因Nlrc5的验证[J]. 姜景夫,兰云刚,李姿,张竞,关继羽,赵魁,高丰,贺文琦,宋德光. 中国兽医学报. 2019(04)
[8]NF-κB亚基泛素化研究进展[J]. 孙婷,陈泉,肖继,王德明. 生理科学进展. 2018(03)
[9]藻酸双脂钠抑制巨细胞病毒诱导小鼠β分泌酶表达的研究（英文）[J]. 杜宇,李娇,孙延龙,陈永,李文通,阮极盟,张曼,刘志军. 中国海洋药物. 2017(06)
[10]莱菔硫烷对鼻咽癌细胞中Klf4表达及侵袭迁移能力的影响[J]. 李锡清,赵尊兰,刘冬玲,刘明月,马宁,周云. 中华实用诊断与治疗杂志. 2017(08)
博士论文
[1]长链非编码RNA SPRY4-IT1作为miR-101-3p分子海绵上调EZH2的表达促进膀胱癌的增殖和转移[D]. 刘东.华中科技大学 2017
硕士论文
[1]长链非编码RNA HCP5通过微小RNA的吸附作用促进甲状腺滤泡癌的进程[D]. 梁磊磊.大连医科大学 2018
本文编号：3360348
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3360348.html
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