鲍曼不动杆菌外膜囊泡Omp33-36对巨噬细胞的调节作用
发布时间：2021-09-02 17:14
目的:鲍曼不动杆菌是一种非发酵革兰阴性杆菌,广泛分布于医院环境,已成为医院感染的重要条件致病菌。鲍曼不动杆菌可通过外膜囊泡（outer membrane vesicles,OMVs）与宿主细胞相互作用,诱导炎症因子的产生,起到杀菌抑菌作用。外膜蛋白Omp33-36是一种可通过OMVs释放的主要毒性蛋白之一,本研究旨在探讨鲍曼不动杆菌外膜蛋白Omp33-36对小鼠巨噬细胞系Raw264.7的调节和在鲍曼不动杆菌感染过程中的作用。方法:（1）常规培养鲍曼不动杆菌ATCC 17978T与ATCC 19606T,差速离心法分离细菌外膜囊泡,通过SDS-PAGE凝胶电泳和考马斯亮蓝染色等方法进行细菌外膜囊泡的鉴定。（2）将分离的外膜囊泡进行系列稀释,取不同浓度的外膜囊泡与小鼠巨噬细胞系Raw264.7共培养,采用CCK-8法测定细胞生存率,以两种标准菌株的外膜囊泡对细胞生存率影响接近的浓度确定为拟用刺激浓度。（3）以三种不同刺激浓度的外膜囊泡与小鼠巨噬细胞系Raw 264.7共培养24 h,测定促炎因子IL-6、TNF-α和抑炎因子IL-10、TGF-...
【文章来源】：江苏大学江苏省
【文章页数】：84 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图2.1两种鲍曼不动杆菌外膜囊泡中蛋白质含量
鲍曼不动杆菌外膜囊泡Omp33-36对巨噬细胞的调节作用18*：P<0.05图2.1两种鲍曼不动杆菌外膜囊泡中蛋白质含量Figure2.1ProteincontentintheoutermembranevesiclesoftwoAcinetobacterbaumannii2.4.2外膜囊泡蛋白分布情况按照步骤2.3.4所述，使用考马斯亮蓝染色检测外膜囊泡中蛋白分布情况，结果表明，两种标准菌株的外膜囊泡中均含有复杂的蛋白质种类，其含量最多的是OmpA，条带位于38kDa处，且在图中还可以看到Omp33-36条带。图2.2菌株ATCC19606T与ATCC17978T外膜囊泡蛋白质SDS-PAGE电泳图Figure2.2SDS-PAGEelectrophoresisofoutermembranevesicleproteinsofstandardstrainsofAcinetobacterbaumanniiATCC19606TandATCC17978TM：蛋白质Marker1：ATCC19606的OMVs2：ATCC17978的OMVs2.4.3CCK-8法分析外膜囊泡对巨噬细胞RAW264.7生存率的影响按照2.3.6中所述步骤，使用CCK-8法分析不同鲍曼不动杆菌标准菌株所产
江苏大学硕士学位论文19生的的外膜囊泡对巨噬细胞RAW264.7的细胞生存率的影响。结果显示：两种标准菌株的外膜囊泡对巨噬细胞RAW264.7的细胞毒性作用并不很强，即使当外膜囊泡浓度达到50μg/mL,巨噬细胞的生存率也保持在80%左右，当外膜囊泡浓度高于15μg/mL后，两种标准菌株的外膜囊泡对细胞生存率的影响趋于相似，因此在本课题的后续试验中，考虑选择15μg/mL,20μg/mL,25μg/mL作为外膜囊泡的刺激浓度。图2.3外膜囊泡刺激巨噬细胞Raw264.7的生存率Figure2.3ThesurvivalrateofmacrophagesRaw264.7stimulatedbyadventitialvesicles2.4.4外膜囊泡刺激后的巨噬细胞RAW264.7相关细胞因子mRNA的检测结果按照2.3.7的实验步骤，利用实时荧光定量PCR检测两标准菌株外膜囊泡处理后巨噬细胞Raw264.7相关细胞因子mRNA水平的表达情况，结果表明：两种标准菌株外膜囊泡处理巨噬细胞Raw264.724h后，促炎因子TNF-α、IL-6的表达水平明显增高；且抑炎因子IL-10、TGF-βATCC17978T外膜囊泡处理组表达水平均有明显增高但ATCC19606T外膜囊泡处理组表达水平则呈下调趋势。综上分析，两种外膜囊泡处理的巨噬细胞均呈现显著的促炎作用，而抑炎因子的表达主要表现在ATCC17978T外膜囊泡刺激的巨噬细胞。这有可能正是细菌自我保护逃避免疫清除的一种机制，且不同菌株因其分泌的外膜囊泡承载的成分差异，这种逃避宿主防御的能力不尽相同。
【参考文献】：
期刊论文
[1]VISTA-Ig融合蛋白的表达及其包涵体复性研究[J]. 张成龙,康巧珍,汲振余,郭勋,杜娟,达甜甜,汪文,刘鑫. 生物技术. 2018(01)
[2]L-精氨酸对提高蛋白质复性与纯化率的作用及其分析[J]. 余秀娟,王骊丽,张如月,高一笑. 内蒙古大学学报(自然科学版). 2017(06)
[3]λRed重组系统用于沙门菌质粒毒力基因spvC敲除株的构建[J]. 高嵩,燕婧,储元元,李嫄渊,吴淑燕. 生物技术. 2016(04)
[4]铜绿假单胞菌phoQ基因敲除对氨基糖苷类抗生素耐药性的影响[J]. 汪浙炯,夏肖萍,楼宏强,孙爱华,严杰. 中华微生物学和免疫学杂志. 2009 (09)
[5]利用Red重组系统对大肠杆菌ClpP基因的敲除[J]. 白光兴,孙志伟,黄莺,俞炜源. 中国生物化学与分子生物学报. 2005(01)
硕士论文
[1]重组人mda-7/IL-24的异源表达、包涵体复性及分离纯化的研究[D]. 王晓娟.华东理工大学 2014
本文编号：3379408
【文章来源】：江苏大学江苏省
【文章页数】：84 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图2.1两种鲍曼不动杆菌外膜囊泡中蛋白质含量
鲍曼不动杆菌外膜囊泡Omp33-36对巨噬细胞的调节作用18*：P<0.05图2.1两种鲍曼不动杆菌外膜囊泡中蛋白质含量Figure2.1ProteincontentintheoutermembranevesiclesoftwoAcinetobacterbaumannii2.4.2外膜囊泡蛋白分布情况按照步骤2.3.4所述，使用考马斯亮蓝染色检测外膜囊泡中蛋白分布情况，结果表明，两种标准菌株的外膜囊泡中均含有复杂的蛋白质种类，其含量最多的是OmpA，条带位于38kDa处，且在图中还可以看到Omp33-36条带。图2.2菌株ATCC19606T与ATCC17978T外膜囊泡蛋白质SDS-PAGE电泳图Figure2.2SDS-PAGEelectrophoresisofoutermembranevesicleproteinsofstandardstrainsofAcinetobacterbaumanniiATCC19606TandATCC17978TM：蛋白质Marker1：ATCC19606的OMVs2：ATCC17978的OMVs2.4.3CCK-8法分析外膜囊泡对巨噬细胞RAW264.7生存率的影响按照2.3.6中所述步骤，使用CCK-8法分析不同鲍曼不动杆菌标准菌株所产
江苏大学硕士学位论文19生的的外膜囊泡对巨噬细胞RAW264.7的细胞生存率的影响。结果显示：两种标准菌株的外膜囊泡对巨噬细胞RAW264.7的细胞毒性作用并不很强，即使当外膜囊泡浓度达到50μg/mL,巨噬细胞的生存率也保持在80%左右，当外膜囊泡浓度高于15μg/mL后，两种标准菌株的外膜囊泡对细胞生存率的影响趋于相似，因此在本课题的后续试验中，考虑选择15μg/mL,20μg/mL,25μg/mL作为外膜囊泡的刺激浓度。图2.3外膜囊泡刺激巨噬细胞Raw264.7的生存率Figure2.3ThesurvivalrateofmacrophagesRaw264.7stimulatedbyadventitialvesicles2.4.4外膜囊泡刺激后的巨噬细胞RAW264.7相关细胞因子mRNA的检测结果按照2.3.7的实验步骤，利用实时荧光定量PCR检测两标准菌株外膜囊泡处理后巨噬细胞Raw264.7相关细胞因子mRNA水平的表达情况，结果表明：两种标准菌株外膜囊泡处理巨噬细胞Raw264.724h后，促炎因子TNF-α、IL-6的表达水平明显增高；且抑炎因子IL-10、TGF-βATCC17978T外膜囊泡处理组表达水平均有明显增高但ATCC19606T外膜囊泡处理组表达水平则呈下调趋势。综上分析，两种外膜囊泡处理的巨噬细胞均呈现显著的促炎作用，而抑炎因子的表达主要表现在ATCC17978T外膜囊泡刺激的巨噬细胞。这有可能正是细菌自我保护逃避免疫清除的一种机制，且不同菌株因其分泌的外膜囊泡承载的成分差异，这种逃避宿主防御的能力不尽相同。
【参考文献】：
期刊论文
[1]VISTA-Ig融合蛋白的表达及其包涵体复性研究[J]. 张成龙,康巧珍,汲振余,郭勋,杜娟,达甜甜,汪文,刘鑫. 生物技术. 2018(01)
[2]L-精氨酸对提高蛋白质复性与纯化率的作用及其分析[J]. 余秀娟,王骊丽,张如月,高一笑. 内蒙古大学学报(自然科学版). 2017(06)
[3]λRed重组系统用于沙门菌质粒毒力基因spvC敲除株的构建[J]. 高嵩,燕婧,储元元,李嫄渊,吴淑燕. 生物技术. 2016(04)
[4]铜绿假单胞菌phoQ基因敲除对氨基糖苷类抗生素耐药性的影响[J]. 汪浙炯,夏肖萍,楼宏强,孙爱华,严杰. 中华微生物学和免疫学杂志. 2009 (09)
[5]利用Red重组系统对大肠杆菌ClpP基因的敲除[J]. 白光兴,孙志伟,黄莺,俞炜源. 中国生物化学与分子生物学报. 2005(01)
硕士论文
[1]重组人mda-7/IL-24的异源表达、包涵体复性及分离纯化的研究[D]. 王晓娟.华东理工大学 2014
本文编号：3379408
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