一种准确、简便测定CRISPR/Cas9基因编辑效率的方法

发布时间：2021-09-17 03:34

　　CRISPR/Cas9基因编辑技术是近年来发展迅速的一项基因定点编辑技术,但对特定CRISPR/Cas9基因编辑技术的编辑效率进行有效评估的方法仍十分匮乏,本研究的目的是建立一种准确、简便测定CRISPR/Cas9基因编辑效率的方法。在我们的方法中,将与种子专一表达启动子（2S3）连接的mCherry荧光蛋白报告基因作为选择基因,并以编码脂肪酸脱氢酶FAD2的基因为靶序列;然后对经CRISPR/Cas9编辑的拟南芥种子进行脂肪酸组分分析,根据其组分变化计算该方法的编辑效率。结果显示,利用mCherry荧光蛋白报告基因的种子专一表达特性,可简便快速地筛选阳性的初级转化子和后代的无转基因突变子;而种子油脂分析法能快速、准确地鉴定CRISPR/Cas9编辑的突变体,可以精确地检测出核酸长度小至单个碱基对的突变,用该方法获得的CRISPR/Cas9基因编辑效率（54.5%～74.1%）远高于基于聚丙烯酰氨凝胶电泳法获得的编辑效率（3.7%～15.4%）。说明,该方法检测CRISPR/Cas9基因编辑效率的高效性与可行性。 

【文章来源】：江苏农业学报. 2020,36(02)北大核心CSCD

【文章页数】：7 页

【部分图文】：

用于快速检测CRISPR/Cas9基因编辑系统编辑效率的双元载体质粒图谱

将编辑基因载体转化到拟南芥获得T1代种子后,使用体式荧光显微镜筛选转基因阳性种子,筛选结果如图2所示。在蓝色激发光下显示红色荧光的种子表示有mCherry荧光蛋白报告基因转入,即为阳性植株。2.2 CRISPR/Cas9基因编辑效率检测

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳法,对荧光筛选获得的转基因阳性植株进行突变与否的鉴定。聚丙烯酰胺凝胶电泳结果(图3)显示,不具有野生型对照条带的为纯合突变植株,既有突变条带又有野生型对照条带的为杂合突变植株,只有野生型对照条带的则为未突变植株。对鉴定结果进行统计从而确定CRISPR/Cas9系统的编辑效率。如表2所示,4次试验的编辑效率分别为15.4%、9.1%、3.7%、4.0%。


本文编号：3397880