谷氨酸棒杆菌合成微生物油脂的代谢途径平衡
发布时间：2021-09-17 01:51
微生物油脂因其具有生产周期短、可连续生产、可规模化利用自然界丰富资源和脂肪酸组成易通过基因工程手段进行改造等特点,是第三代生物柴油重要的原料来源。实验室前期构建了微生物油脂生产菌株谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）CT14,本课题在此基础上进行系统代谢工程改造,进一步研究和探索微生物油脂合成及调控机制。首先,强化前体之一3-磷酸甘油的供给。C.glutamicum CT14只强化了脂肪酸的供给,大量脂肪酸溢出胞外造成浪费。为了平衡合成甘油三酯（TAG）两种前体物质的供给,减少胞外游离脂肪酸的含量,对前体3-磷酸甘油合成途径进行了调控。涉及到的基因有glpD、gpsA和gpp,通过发酵分析比较单个基因以及三个基因不同串联组合表达对菌株胞内外脂肪酸和微生物油脂合成的影响,获得最优的基因组合改造策略,过表达gpsA并敲除基因glpD,菌株胞外游离脂肪酸基本为零,总脂肪酸产量达到1.8 g/L,甘油三酯（TAG）含量有5～10%的提高。其次,强化TAG合成限速步骤。文献表明,谷氨酸棒杆菌的基因组中没有明确标注的GPAT功能基因。本课题对谷氨酸棒杆菌TAG合成途...
【文章来源】：华东理工大学上海市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：86 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．２谷氨酸棒杆菌ＡＴＣＣ１３０３２Ｉ３７丨??
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。在设计引物时，引物ＧＣ含量设计在４０％？６０％之间，退火温度不易??过低且每条引物退火温度相差不能太大。??（２）基因ｇ／ｐＺ）上下游同源臂的融合??以Ｃ：?ｇ／＿ｗ／ｃ臓ＡＴＣＣ１３０３２基因组为模板，用ＮＥＢ的热启动Ｔａｑ聚合酶验证ＰＣＲ??条件然后用Ｐｈｕｓｉｏｎ高保真酶大量扩增片段。用引物ｇｌｐ－Ｄｌ和ｇｌｐ－Ｄ２扩增基因ｇ／ｐＤ的??上游片段ｇｌｐＤ－Ｕ大小是５０５?ｂｐ，用引物ｇｌｐ－Ｄ３和ｇｌｐ－Ｄ４扩增基因ｇ／ｐＺ）的下游片段??ｇｌｐＤ－Ｄ大小是５４４ｂｐ?（见下图３．２左）。将上下游片段切胶回收后作为模再利用引物对??§１卩－〇１／〇４来扩增上下游融合片段１０３２?５口（见下图３．２右）。???＾???（Ｊ１－？ｄ２?ｄ３＾ｄ４?ｅｘＵｅｘ２?ａｘ３＋ｅｘ４?ｄｌ？ｄ２?ｄ３＋＜Ｊ４?ａｌｐＤ?＇?＂＂?ａｏｓＡ．?Ｑｐｐ?’??ｄＨ＜Ｊ４?ｅｘＨｅｘ４?ｄ１？ｄ４?，??－?＇?Ｙ＇?＇?＂Ｗｍ＇??ｒ?一、．‘．?＇：?．…?－１．５??ｉ．〇？…?一ｔａｗ?——１°??Ｗ?＾?一―?一一一—一—?肩?＇?”?一?一０．５??图３．２妳Ｚ）基因上下游同源臂重叠ＰＣＲ??Ｆｉｇ．３．２?Ｔｈｅ?ｆｕｓｉｏｎ?ＰＣＲ?ｏｆ?ｇｌｐＤ－Ｕ?ａｎｄ?ｇｌｐＤ－Ｄ??（３）?ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ－ｇ丨ｐＤ敲除载体构建??将重叠ＰＣＲ产物片段ｇｌｐＤ－Ｕｌ）和敲除质粒ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ使用ＮＥＢ的限制性内切??酶五ｃｏＲ丨和执〃？ｉＨＮ双酶切后在去磷酸化，经过纯化试剂盒纯化后Ｔ４酶过夜连接转化??大肠杆菌感受态，利用验证引物对ＰＫ１８－Ｔ１／
本文编号：3397721
【文章来源】：华东理工大学上海市 211工程院校 教育部直属院校
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【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．２谷氨酸棒杆菌ＡＴＣＣ１３０３２Ｉ３７丨??
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