双峰驼天然纳米抗体库的构建及NGS测序鉴定多样性的应用研究
发布时间：2021-09-24 21:55
纳米抗体是由骆驼科或软骨鱼体内仅由重链组成的特殊抗体的可变区克隆得到的最小的蛋白质功能域,应用前景十分宽广。本课题首先探究了骆驼源样本RNA的提取方法,并对其提取条件进行了优化;利用优化后的方法获取了 20峰双峰驼外周血淋巴细胞和1峰双峰驼脾脏细胞RNA,经cDNA反转、扩增、连接噬菌体,电转化等步骤构建了 4个驼源天然纳米抗体库,采用固体菌落计数法和高通量测序技术对四个文库的库容量和多样性进行了鉴定。结果如下。1.RNA提取优化实验的结果显示,两种提取方法得到的RNA的A260/A280值和A260/A230值的数据均处于正常值区间;RNA的得率方面,沉淀法优于硅基膜法,是其2倍以上;RT-PCR检测发现硅基膜法提取的RNA可见目的条带。2.噬菌体展示文库实验结果显示,成功构建了 CNL1、CNL2、CNL3和CNL4四个抗体文库,且库容量均较好,分别为4.21× 109、4.10×109、1.74×109和4.10×109。经随机克隆抽样验证插入率,表明四个抗体库的插入率均为100%。3.高通量测序数据显示唯一序列与非唯一序列的比例分别为87.70%、89.22%、89.84%和8...
【文章来源】：内蒙古农业大学内蒙古自治区
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１技术路线图??Ｆｉｇ．?１?Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ?ｒｏａｄ?ｍａｐ??
８３．００ａ±４８．５７?１?３５３．００ｂ±８６．６０?０．１２?０．０６?２．００??８０?３?０２３．００＾：１７６．７０?１?１２５．００ｂ±３３．２８?０．１１?０．０４?２．７５??注：得率：浓度Ｘ体积／脾脏用量（体积３０．０?ｎＬ）；同一行上标相同字母代表差异不显著（尸＞０．０５），不同字母??代表差异显著（ｐ＜〇．〇５）。??为了更直观的探宄ＴＲＩｚｏｌ试剂用量与脾脏组织用量对两种方法提取总ＲＮＡ浓??度的影响，根据脾脏组织用量与最终的ＲＮＡ提取浓度数据，作了如图２所示的拟??合曲线。图２显示，随着脾脏量的增加，无论沉淀法还是硅基膜法均呈现上升的趋??势，且沉淀法比硅基膜法上升较快；沉淀法的拟合方程为Ｙ＝３９．７２３Ｘ＋２６．７３３，??Ｒ２＝０．９８８２，拟合程度很好，说明沉淀法提取ＲＮＡ较为稳定可靠，且在脾脏量７０?ｍｇ??与８０?ｍｇ处，两者的ＲＮＡ浓度非常接近，上升趋势趋于平缓；硅基膜法拟合方程??为Ｙ＝１７．１８４Ｘ＋４４．３９６，?Ｒ２＝０．８８３４，拟合程度较差，结合图中曲线走向，由此说明??相较于沉淀法，硅基膜法对骆驼脾脏ＲＮＡ的提取效果不好，稳定性差，对于珍贵??的样品而言，无疑沉淀法是好的选择。??３：００??｝?＝?３９?７２３Ａ＞２６．７３３?．．．．??二汹０?？?Ｒ：?＝?０．９８８２?＞４．．？？＊？＊＊＇?Ａ??备?一００?．?ｉ??７＝?１７?１８４Ｘ－?４４．３９６??Ｓ?２０００?？?？？？？？，．＊．?？?Ｒ：?＝?０．ＳＳ３４??＾?１５００?？?－??１０００?．?．／？？？？．．．?一一一??一?＿?－?－??５００?．
?内蒙古农业大学硕士学位论文?２１＿??３．１．２琼脂糖凝胶电泳检测结果??利用琼脂糖凝胶电泳对两种方法提取的骆驼脾脏组织ＲＮＡ和血液淋巴细胞??ＲＮＡ进行提取质量检测，结果如图３和图４所７Ｋ。如图３ａ所７Ｋ，对米用沉淀法得??到的骆驼脾脏组织ＲＮＡ做了琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示１０?ｍｇ？８０?ｍｇ的脾脏??添加量均出现３条带，且条带的明亮程度逐渐增强，这表明所获得的ＲＮＡ浓度逐??渐上升，此外条带较为清晰分明，表明ＲＮＡ基本无降解情况出现，这均与超微量??分光光度计的测定结果保持一致。由图３ｂ可知，硅基膜法提取的ＲＮＡ只能看到２８??Ｓ和１８?Ｓ这２个条带，这与文献报道的结果保持一致［９７］；此外ＲＮＡ条带清晰分明，??基本未有降解，且１０?ｍｇ？５０?ｍｇ脾脏量时，条带亮度呈逐渐增强的态势，而５０?ｍｇ？８０??ｍｇ的脾脏量时，条带亮度变化较少，这与超微量分光光度计的浓度检测结果保持??一致。就柱纯化法提取ＲＮＡ而言，其ＲＮＡ的得率会趋于一个饱和值，这与硅基膜??的富集能力有很大关系，即硅基膜的ＲＮＡ富集能力有限。通过图４可知，硅基膜??法提取的血液淋巴细胞总ＲＮＡ仅有２８?Ｓ和１８?Ｓ两条条带明亮，沉淀法提取的ＲＮＡ??有三条条带，富集到了分子量小的５?Ｓ条带，ＲＮＡ收集比较全。??Ｍ?１２３４５６７８?Ｍ?１?２?３?４?５?６?７?Ｓ??ａ沉，芯対：ｉ取睥．眺总ＲＮＡ?ｂ砘坫膜法提収陴脏总ＲＮＡ??图３骆驼脾脏组织总ＲＮＡ电泳图??Ｆｉｇ．３?Ｃａｍｅｌ?ｓｐｌｅｅｎ?ｔｉｓｓｕｅ?ｔｏｔａｌ?ＲＮＡ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ??注：１？８，脾脏用量?１０ｍｇ￣８０ｍｇ；?Ｍ，ＤＬ－２?
本文编号：3408501
【文章来源】：内蒙古农业大学内蒙古自治区
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１技术路线图??Ｆｉｇ．?１?Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ?ｒｏａｄ?ｍａｐ??
８３．００ａ±４８．５７?１?３５３．００ｂ±８６．６０?０．１２?０．０６?２．００??８０?３?０２３．００＾：１７６．７０?１?１２５．００ｂ±３３．２８?０．１１?０．０４?２．７５??注：得率：浓度Ｘ体积／脾脏用量（体积３０．０?ｎＬ）；同一行上标相同字母代表差异不显著（尸＞０．０５），不同字母??代表差异显著（ｐ＜〇．〇５）。??为了更直观的探宄ＴＲＩｚｏｌ试剂用量与脾脏组织用量对两种方法提取总ＲＮＡ浓??度的影响，根据脾脏组织用量与最终的ＲＮＡ提取浓度数据，作了如图２所示的拟??合曲线。图２显示，随着脾脏量的增加，无论沉淀法还是硅基膜法均呈现上升的趋??势，且沉淀法比硅基膜法上升较快；沉淀法的拟合方程为Ｙ＝３９．７２３Ｘ＋２６．７３３，??Ｒ２＝０．９８８２，拟合程度很好，说明沉淀法提取ＲＮＡ较为稳定可靠，且在脾脏量７０?ｍｇ??与８０?ｍｇ处，两者的ＲＮＡ浓度非常接近，上升趋势趋于平缓；硅基膜法拟合方程??为Ｙ＝１７．１８４Ｘ＋４４．３９６，?Ｒ２＝０．８８３４，拟合程度较差，结合图中曲线走向，由此说明??相较于沉淀法，硅基膜法对骆驼脾脏ＲＮＡ的提取效果不好，稳定性差，对于珍贵??的样品而言，无疑沉淀法是好的选择。??３：００??｝?＝?３９?７２３Ａ＞２６．７３３?．．．．??二汹０?？?Ｒ：?＝?０．９８８２?＞４．．？？＊？＊＊＇?Ａ??备?一００?．?ｉ??７＝?１７?１８４Ｘ－?４４．３９６??Ｓ?２０００?？?？？？？？，．＊．?？?Ｒ：?＝?０．ＳＳ３４??＾?１５００?？?－??１０００?．?．／？？？？．．．?一一一??一?＿?－?－??５００?．
?内蒙古农业大学硕士学位论文?２１＿??３．１．２琼脂糖凝胶电泳检测结果??利用琼脂糖凝胶电泳对两种方法提取的骆驼脾脏组织ＲＮＡ和血液淋巴细胞??ＲＮＡ进行提取质量检测，结果如图３和图４所７Ｋ。如图３ａ所７Ｋ，对米用沉淀法得??到的骆驼脾脏组织ＲＮＡ做了琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示１０?ｍｇ？８０?ｍｇ的脾脏??添加量均出现３条带，且条带的明亮程度逐渐增强，这表明所获得的ＲＮＡ浓度逐??渐上升，此外条带较为清晰分明，表明ＲＮＡ基本无降解情况出现，这均与超微量??分光光度计的测定结果保持一致。由图３ｂ可知，硅基膜法提取的ＲＮＡ只能看到２８??Ｓ和１８?Ｓ这２个条带，这与文献报道的结果保持一致［９７］；此外ＲＮＡ条带清晰分明，??基本未有降解，且１０?ｍｇ？５０?ｍｇ脾脏量时，条带亮度呈逐渐增强的态势，而５０?ｍｇ？８０??ｍｇ的脾脏量时，条带亮度变化较少，这与超微量分光光度计的浓度检测结果保持??一致。就柱纯化法提取ＲＮＡ而言，其ＲＮＡ的得率会趋于一个饱和值，这与硅基膜??的富集能力有很大关系，即硅基膜的ＲＮＡ富集能力有限。通过图４可知，硅基膜??法提取的血液淋巴细胞总ＲＮＡ仅有２８?Ｓ和１８?Ｓ两条条带明亮，沉淀法提取的ＲＮＡ??有三条条带，富集到了分子量小的５?Ｓ条带，ＲＮＡ收集比较全。??Ｍ?１２３４５６７８?Ｍ?１?２?３?４?５?６?７?Ｓ??ａ沉，芯対：ｉ取睥．眺总ＲＮＡ?ｂ砘坫膜法提収陴脏总ＲＮＡ??图３骆驼脾脏组织总ＲＮＡ电泳图??Ｆｉｇ．３?Ｃａｍｅｌ?ｓｐｌｅｅｎ?ｔｉｓｓｕｅ?ｔｏｔａｌ?ＲＮＡ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ??注：１？８，脾脏用量?１０ｍｇ￣８０ｍｇ；?Ｍ，ＤＬ－２?
本文编号：3408501
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