非洲爪蛙prmt5.L基因的克隆及时空表达谱分析

发布时间：2021-10-10 00:12

　　[目的]克隆非洲爪蛙prmt5. L基因并分析其在胚胎发育中的时空表达谱。[方法]收集胚胎,提取总RNA,反转录制备c DNA。设计特异引物,PCR扩增prmt5. L基因的ORF序列,连接到p CS2+载体构建p CS2+prmt5. L重组质粒,连接位点为EcoRⅠ和XhoⅠ。经双酶切和测序验证成功构建p CS2+prmt5. L重组质粒。将p CS2+prmt5. L重组质粒用EcoRⅠ酶切,T7 RNA聚合酶转录获得prmt5. L的反义探针。收集不同时期的爪蛙胚胎,固定并脱水后经原位杂交检测prmt5. L在胚胎发育中的表达情况。通过序列比对和进化树分析PRMT5在进化中的保守性。[结果]成功克隆非洲爪蛙prmt5. L基因,原位杂交检测了prmt5. L在早期胚胎中的时空表达谱。序列比对和进化树发现prmt5. L蛋白在进化中非常保守。[结论]成功构建了p CS2+prmt5. L重组质粒。prmt5. L基因在胚胎发育中呈现动态表达且prmt5. L蛋白在进化中非常保守。 

【文章来源】：生物技术. 2020,30(01)

【文章页数】：6 页

【部分图文】：

非洲爪蛙胚胎总RNA电泳图

以制备好的cDNA为模板，PCR扩增非洲爪蛙prmt5.L基因的ORF序列，电泳检测PCR扩增得到的目的片段。结果显示，获得特异的大小在2 kb左右的目的片段。该目的片段大小与从NCBI数据库中查得的非洲爪蛙prmt5.L基因(GenBank序列号:NM＿001095149)的CDS序列大小一致。2.3 pCS2+prmt5.L重组载体的构建以及双酶切鉴定

将PCR产物纯化后用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切，与此同时双酶切pCS2+载体，将酶切好的目的片段和pCS2+载体纯化后连接，构建重组载体。将该重组载体转化到大肠杆菌中，过夜培养后提取质粒。用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切提取的质粒，电泳检测。结果显示，双酶切产物有两条带，大于2 kb的条带为pCS2+载体，另一条2 kb的条带为目的片段。将双酶切验证正确的重组载体送样测序，然后将测序结果在NCBI数据库中进行比对，比对结果显示PCR扩增得到的prmt5.L的ORF序列与数据库中的一致，说明成功构建了pCS2+prmt5.L重组载体。2.4 prmt5.L反义探针的制备


本文编号：3427261