人巨细胞病毒在T98G细胞中从潜伏到激活过程中转录差异的分析

发布时间：2021-10-11 06:45

　　目的:人巨细胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV）在人群中普遍感染,具有潜伏-激活的感染特点。易在新生儿、器官移植及HIV等免疫力低下患者内激活引起严重并发症和后遗症,甚至造成死亡。HCMV具有严格的种属特异性,仅感染人,没有良好的动物模型,对潜伏激活的研究常通过细胞模型。本研究通过建立神经胶质母细胞瘤细胞T98G的HCMV潜伏再激活模型,收集潜伏和激活状态不同时间点的感染细胞进行转录组高通量测序。分析潜伏和激活感染状态转录水平存在显著差异的宿主细胞转录调控相关基因。探讨基因转录调控机制在HCMV感染再激活过程中的作用。为进一步探讨HCMV潜伏再激活机制提供实验依据。研究方法:1.建立HCMV感染T98G细胞潜伏模型:T98G细胞采用无血清饥饿法饥饿78h后,铺于150mm细胞培养皿中（2×10⁶cells/dish）,2小时内待细胞贴壁后以感染复数为10感染HCMV实验株Towne BAC,感染后16小时用PBS清洗一次并更换为全新的培养基。培养7天进行传代,传代过程中收集每代的细胞样品检测病毒基因组拷贝数及相关基因的RNA转录水平,收集... 

【文章来源】：中国医科大学辽宁省

【文章页数】：65 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

cDNA文库构建过程

中国医科大学硕士学位论文14图2.2HISAT比对参考基因组示意图2.2.7验证CEBPD在病毒激活中的作用2.2.7.1CEBPD测序结果验证（1）qPCR检测CEBPD的RNA水平设计引物检测测序样品的CEBPD的RNA表达，引物及具体方法见上。（2）Westernblot检测CEBPD的蛋白表达水平对测序样品采用westernblot方法检测CEBPD的蛋白表达，抗体见上，详细方法见下。2.2.7.2应用siRNA干扰技术下调CEBPD的表达HCMV感染的T98G细胞传代到建立潜伏时即PX代细胞，在PX代细胞长满单层的第7天消化后铺于六孔板中（3×105/孔），第二天转染CEBPD-siRNA

中国医科大学硕士学位论文183实验结果3.1建立HCMV在T98G细胞中的潜伏感染模型HCMV以MOI=10感染T98G细胞，每7天传代一次，观察发现HCMV感染T98G细胞第7天（P0代），细胞中GFP信号不足50%，随着传代，细胞中的GFP信号不断减少，至P7代时大部分视野均无GFP信号，偶在一个视野可见散在一两个GFP信号。收集每代T98G细胞的上清接种到HFF细胞中培养14天观察发现P4代之前的上清接种的HFF细胞中均有明显的GFP信号，随着传代GFP信号不断减少，至P7代上清接种的HFF细胞中未观察到绿色荧光（图3.1）。上清中病毒滴度检测结果表明P0代上清中病毒滴度高达300PFU/ml，P7代上清中空斑计数为0，未检出到感染性病毒颗粒（图3.2）。图3.1T98G细胞及上清中HCMV感染结果图3.2T98G培养上清病毒滴度结果

【参考文献】：
期刊论文
[1]人巨细胞病毒感染促动脉粥样硬化的机制[J]. 申广辉,曹丽娟,陈福祥.  国际心血管病杂志. 2017(05)
[2]人巨细胞病毒潜伏感染机制的研究进展[J]. 高慧慧,陶然,俞惠民,尚世强.  病毒学报. 2016(01)



本文编号：3429994