蛋白质-RNA相互作用鉴定技术研究进展
发布时间:2021-10-12 15:10
RNA结合蛋白(RNA binding protein, RBP)是基因表达调控的关键因子,参与包括蛋白质复合物的协调与稳定、RNA的加工与成熟以及mRNA的转运、稳定、翻译和降解等重要的细胞生物学过程。而RBP和RNA之间的相互作用可以在它们各自的生物学过程中起到重要作用。因此,快速、准确检测RBP-RNA相互作用的技术对研究RBP和RNA的功能至关重要。对近些年发展起来的RNA纯化的染色质分离(chromatin isolation by RNA purification,ChIRP)、RNA靶标的捕获杂交分析(capture hybridization analysis of RNA targets,CHART)、三分子荧光互补技术(trimolecular fluorescence complementation,TriFC)、RNA免疫共沉淀(RNA immunoprecipitation, RIP)、紫外交联免疫沉淀(UV-crosslinking and immunoprecipitation,CLIP)、RNA Pull-down和RNA电泳迁移分析等主要RBP-RNA...
【文章来源】:生物技术进展. 2020,10(03)
【文章页数】:9 页
【部分图文】:
TriFC技术原理示意图
传统的CLIP方法在逆转录过程中,交联位点氨基酸残留会引起逆转录的突变、缺失甚至是终止,导致缺少5′接头的截短cDNA,而3′接头和5′接头是后续PCR扩增所必须的,致使截断短的cDNA在CLIP中没有扩增,为了解决这一问题,K?nig等[39]在CLIP基础上开发了单核苷酸分离CLIP(iCLIP)技术。iCLIP技术可巧妙利用交联位置能够抑制逆转录的进行这一特点,通过RT引物将3′接头与cDNA相连,再在环化酶的作用下将cDNA环化,随后再通过RT引物中的BamHⅠ酶切位点使环状cDNA线性化,实现对正常和截短的cDNAs的扩增和测序,从而可以在单核苷酸水平上精确的确定蛋白质-RNA交联位点(图2)。iCLIP技术已经成功地应用于RBPs在选择性剪接、可变聚腺苷酸化、RNA甲基化、mRNA稳定性等方面的功能研究[40-43]。通过该技术确定了不同RBPs的高分辨率RNA剪接图谱,从而能够评估RBP结合在替代外显子周围的位置如何决定它们的剪接功能,更重要的是,除了识别RBP结合位点外,iCLIP还可以对RBP-RNA相互作用的动态变化进行定量分析。例如,通过定量iCLIP数据证实RNA结合蛋白hnRNPC与剪接因子U2AF65在许多剪接位点上存在竞争关系,hnRNPC的缺失导致U2AF65获得了数百个Alu元件的识别权,致使先前被抑制的Alu外显子错误的形成,这严重破坏了转录本功能,而hnRNPC在正常生理条件下能够阻止这种错误识别,进而在全基因组范围内维持转录组的稳定发挥了关键作用[44]。1.5.4 优化的CLIP(enhanced CLIP,eCLIP)
尽管iCLIP很大程度地提高了分辨率,消除了PCR扩增的偏好性,提高了其扩增效率,但由于iCLIP反应步骤较多,环化效率不高,熟练操作较困难,且需消耗大量的原材料,这些都限制了iCLIP的广泛应用。Van Nostrand等[45]在iCLIP技术基础上对该技术进行进一步改进,提出了一种全新的CLIP方法,称为优化的CLIP(eCLIP)。该方法分两步去添加接头,首先将一个3′RNA接头连接到交联的RNA片段上,逆转录后再将一个3′ssDNA接头连接到逆转录终止端cDNA处,舍去了环化这一步,降低了连接失败导致的RNA片段损失,而且大大缩短了实验的手动操作时间(图3)。而eCLIIP技术结合高通量测序,极大的提高了建库的成功率,改进之后的方法相比普通的CLIP-seq而言,RBPs靶标识别率提高了2~3倍,该方法为RBPs在全基因组范围内的maps提供了一个更加强大、标准化的框架。利用此方法,科学家们揭示了众多蛋白调控RNA的新功能,如eIF4A3在转录后基因调控中的作用[46], MOV10-mRNA 3′UTR和MOV10L1-piRNA在哺乳动物睾丸发育中的调控机制[47]。1.5.5 基于SpyTag的CLIP(SpyTag-based CLIP,SpyCLIP)
【参考文献】:
期刊论文
[1]RNA结合蛋白与RNA相互作用鉴定技术[J]. 陈伟,许馨,孙绍光. 中国生物化学与分子生物学报. 2017(02)
[2]利用CLIP技术研究蛋白质和RNA的相互作用[J]. 周德建,叶克穷. 生命科学. 2014(03)
本文编号:3432812
【文章来源】:生物技术进展. 2020,10(03)
【文章页数】:9 页
【部分图文】:
TriFC技术原理示意图
传统的CLIP方法在逆转录过程中,交联位点氨基酸残留会引起逆转录的突变、缺失甚至是终止,导致缺少5′接头的截短cDNA,而3′接头和5′接头是后续PCR扩增所必须的,致使截断短的cDNA在CLIP中没有扩增,为了解决这一问题,K?nig等[39]在CLIP基础上开发了单核苷酸分离CLIP(iCLIP)技术。iCLIP技术可巧妙利用交联位置能够抑制逆转录的进行这一特点,通过RT引物将3′接头与cDNA相连,再在环化酶的作用下将cDNA环化,随后再通过RT引物中的BamHⅠ酶切位点使环状cDNA线性化,实现对正常和截短的cDNAs的扩增和测序,从而可以在单核苷酸水平上精确的确定蛋白质-RNA交联位点(图2)。iCLIP技术已经成功地应用于RBPs在选择性剪接、可变聚腺苷酸化、RNA甲基化、mRNA稳定性等方面的功能研究[40-43]。通过该技术确定了不同RBPs的高分辨率RNA剪接图谱,从而能够评估RBP结合在替代外显子周围的位置如何决定它们的剪接功能,更重要的是,除了识别RBP结合位点外,iCLIP还可以对RBP-RNA相互作用的动态变化进行定量分析。例如,通过定量iCLIP数据证实RNA结合蛋白hnRNPC与剪接因子U2AF65在许多剪接位点上存在竞争关系,hnRNPC的缺失导致U2AF65获得了数百个Alu元件的识别权,致使先前被抑制的Alu外显子错误的形成,这严重破坏了转录本功能,而hnRNPC在正常生理条件下能够阻止这种错误识别,进而在全基因组范围内维持转录组的稳定发挥了关键作用[44]。1.5.4 优化的CLIP(enhanced CLIP,eCLIP)
尽管iCLIP很大程度地提高了分辨率,消除了PCR扩增的偏好性,提高了其扩增效率,但由于iCLIP反应步骤较多,环化效率不高,熟练操作较困难,且需消耗大量的原材料,这些都限制了iCLIP的广泛应用。Van Nostrand等[45]在iCLIP技术基础上对该技术进行进一步改进,提出了一种全新的CLIP方法,称为优化的CLIP(eCLIP)。该方法分两步去添加接头,首先将一个3′RNA接头连接到交联的RNA片段上,逆转录后再将一个3′ssDNA接头连接到逆转录终止端cDNA处,舍去了环化这一步,降低了连接失败导致的RNA片段损失,而且大大缩短了实验的手动操作时间(图3)。而eCLIIP技术结合高通量测序,极大的提高了建库的成功率,改进之后的方法相比普通的CLIP-seq而言,RBPs靶标识别率提高了2~3倍,该方法为RBPs在全基因组范围内的maps提供了一个更加强大、标准化的框架。利用此方法,科学家们揭示了众多蛋白调控RNA的新功能,如eIF4A3在转录后基因调控中的作用[46], MOV10-mRNA 3′UTR和MOV10L1-piRNA在哺乳动物睾丸发育中的调控机制[47]。1.5.5 基于SpyTag的CLIP(SpyTag-based CLIP,SpyCLIP)
【参考文献】:
期刊论文
[1]RNA结合蛋白与RNA相互作用鉴定技术[J]. 陈伟,许馨,孙绍光. 中国生物化学与分子生物学报. 2017(02)
[2]利用CLIP技术研究蛋白质和RNA的相互作用[J]. 周德建,叶克穷. 生命科学. 2014(03)
本文编号:3432812
本文链接:https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3432812.html
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