天然鼠源噬菌体单链抗体库的构建及抗西马特罗单链抗体的筛选与特性研究
发布时间：2021-10-12 15:32
为了解决食品安全问题及改善非法添加物在我国明令禁止而屡禁不止的现象。利用噬菌体展示技术构建库容量大、适应性强、稳定性高的多样化重组抗体资源库,旨在筛选出特异性强、亲和力高的食品安全危害物重组抗体以应对突发食品安全事件,为建立快速高效的检测方法奠定基础。本研究选取β-兴奋剂类药物中的西马特罗（Cimaterol,CIM）进行研究。采用聚合酶链式反应技术（PCR）和逆转录PCR（RT-PCR）技术,从未经免疫的健康BALB/c小鼠脾脏中提取RNA,以经RT-PCR获得的鼠源c DNA第一链为模板,设计引物扩增鼠源抗体重链（VH）和轻链（VL）可变区基因,利用重叠延伸PCR（SOE-PCR）扩增鼠源单链抗体（Sc Fv）基因。通过DNA连接、电转等技术构建重组噬菌粒,经辅助噬菌体M13K07救援后,构建天然鼠源噬菌体Sc Fv文库。基因测序分析抗体基因的多样性和完整性。应用重氮化法制备人工免疫抗原CIM-BSA和检测抗原CIM-OVA,并用UV、SDS-PAGE、质谱三种方法进行完全抗原的鉴定。进而以人工完全抗原为靶抗原,对构建的鼠源噬菌体Sc Fv文库进行亲和淘选,使携带抗西马特罗表面抗原...
【文章来源】：郑州大学河南省 211工程院校
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
SOE-PCR拼接ScFv抗体基因ScFvForSfiIScFvScFvRevNotI
第二章鼠源天然抗体库的构建与鉴定22骤完成后，微量核酸分析仪检测RNA浓度及纯度，结果显示鼠基因组DNA浓度为1239ng/μL，A260/A280为1.903。进行琼脂糖凝胶电泳鉴定时为了防止RNA降解，将电泳的胶槽等电泳设备及上样的枪头用DEPC水浸泡[50]。完整的RNA进行琼脂糖电泳时，会出现28S和18SrRNA两条条带且前者亮度比后者强一倍左右，由电泳结果（图2.2）可知提取的RNA完整性良好。图2.2小鼠RNA电泳结果1-3：RNA样品Figure2.2RNAagarosegelelectrophoresisassays1-3:RNAsamples2.3.2VH与VL的电泳结果重链可变区上游引物有5条，下游引物4条，可以组成的重链PCR扩增组合有20对。轻链可变区上游引物有5条，下游引物有3条，可以组成的PCR扩增组合有15对。同时考虑每条引物的兼并性，提高VH、VL可变区的多样性，分别对VH、VL扩增，扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测并回收。结果如图2.3所示。VH片段大小为432bp（图2.3A），VL片段大小为312bp（图2.3B），与预期结果相符，研究结果表明，可以用于ScFv的合成。123
第二章鼠源天然抗体库的构建与鉴定23图2.3VH与VL电泳结果Maker：DL2000DNAMarker；1-2（A）：VH基因产物；1-2（B）：VL基因产物Figure2.3VHandVLagarosegelelectrophoresisassaysMaker:DL2000DNAMarker;1-2(A):VHgeneproducts;1-2(B):VLgeneproducts2.3.3ScFv扩增的电泳结果VH、VL大量扩增用胶回收试剂盒回收纯化，采用SOE-PCR法合成ScFv全长基因，片段大小约为780bp，电泳鉴定后，大量扩增并回收，回收产物即为小鼠单链抗体基因。结果如图2.4所示。图2.4ScFv扩增电泳结果Maker：DL2000DNAMarker；1-4:ScFv基因产物（A）Maker12（B）Maker12－312bp100bp100bp－750bp500bp2000bp2000bp5000bp1000bp250bp3000bp1000bp1500bp750bp500bp250bp－432bp－－－－－－－－－－－－－Figure2.4ElectrophoresisassaysofScFvamplifiedMaker:DL2000DNAMarker;1-4:ScFvgeneproducts
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪圆环病毒2型Cap蛋白原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化[J]. 刘玉伟,辛长勋,孙盼盼,王硕,高梅,时建立,彭喆,吴晓燕,王永明,李俊. 黑龙江畜牧兽医. 2019(24)
[2]天然鼠源噬菌体抗体库的构建及抗鸡堆型艾美耳球虫裂殖子单链抗体的筛选（英文）[J]. 康茜,任志军,唐欣浩,王雪伟,陈颖彬,刘立元,秦建华,赵月兰. 中国兽医学报. 2018(11)
[3]高通量筛选大容量抗体库的方法学研究进展[J]. 赵雪玉,吴蓉. 西北国防医学杂志. 2018(01)
[4]肉品生产中禁用药物西马特罗研究进展[J]. 熊琳,萍阎,高雅琴,李维红,杨晓玲. 食品安全质量检测学报. 2017(01)
[5]西马特罗单克隆抗体的制备及免疫学特性鉴定[J]. 李君华,吴萌,程华,李亚璞,闫静辉,李春生. 畜牧与兽医. 2016(03)
[6]西马特罗免疫抗原合成方法的比较[J]. 李春生,李君华,武孝利,李素红,闫静辉,吴萌. 畜牧与兽医. 2014(08)
[7]动物性食品中β-兴奋剂残留概述[J]. 翟福丽,赖克强,张衍亮,黄轶群. 食品科学. 2011(05)
[8]我国动物疫病防控的问题与思考[J]. 张改平. 中国家禽. 2011(01)
[9]噬菌体抗体库中筛选抗GST单链抗体及其活性鉴定[J]. 唐喆伟,韩红辉,杜冰,王群,钱旻,李恺. 现代免疫学. 2010(05)
[10]抗EGFRvⅢ噬菌体抗体库的构建和筛选[J]. 周敏,石必枝,顾健人,李宗海. 中国生物工程杂志. 2010(04)
硕士论文
[1]广谱有机磷农药单克隆抗体、单链抗体的制备及免疫检测技术研究[D]. 张晓帅.兰州大学 2018
[2]噬菌体天然抗体库淘选及筛选方法的优化[D]. 蒋红欣.上海交通大学 2018
[3]猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白噬菌体单链抗体库的构建与筛选[D]. 张秋丽.郑州大学 2017
[4]GPC3单链抗体的筛选、多克隆抗体制备以及在肝细胞癌检测中的应用[D]. 汪胜豪.浙江大学 2018
[5]抗猪流行性腹泻病毒猪源化嵌合单链抗体scFv-Fc的构建、表达及活性鉴定[D]. 宋晓峰.河南农业大学 2016
[6]重叠延伸PCR（SOE PCR）技术在洛伐他汀九酮合成酶基因克隆中的应用[D]. 黄卓.海南大学 2010
本文编号：3432839
【文章来源】：郑州大学河南省 211工程院校
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
SOE-PCR拼接ScFv抗体基因ScFvForSfiIScFvScFvRevNotI
第二章鼠源天然抗体库的构建与鉴定22骤完成后，微量核酸分析仪检测RNA浓度及纯度，结果显示鼠基因组DNA浓度为1239ng/μL，A260/A280为1.903。进行琼脂糖凝胶电泳鉴定时为了防止RNA降解，将电泳的胶槽等电泳设备及上样的枪头用DEPC水浸泡[50]。完整的RNA进行琼脂糖电泳时，会出现28S和18SrRNA两条条带且前者亮度比后者强一倍左右，由电泳结果（图2.2）可知提取的RNA完整性良好。图2.2小鼠RNA电泳结果1-3：RNA样品Figure2.2RNAagarosegelelectrophoresisassays1-3:RNAsamples2.3.2VH与VL的电泳结果重链可变区上游引物有5条，下游引物4条，可以组成的重链PCR扩增组合有20对。轻链可变区上游引物有5条，下游引物有3条，可以组成的PCR扩增组合有15对。同时考虑每条引物的兼并性，提高VH、VL可变区的多样性，分别对VH、VL扩增，扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测并回收。结果如图2.3所示。VH片段大小为432bp（图2.3A），VL片段大小为312bp（图2.3B），与预期结果相符，研究结果表明，可以用于ScFv的合成。123
第二章鼠源天然抗体库的构建与鉴定23图2.3VH与VL电泳结果Maker：DL2000DNAMarker；1-2（A）：VH基因产物；1-2（B）：VL基因产物Figure2.3VHandVLagarosegelelectrophoresisassaysMaker:DL2000DNAMarker;1-2(A):VHgeneproducts;1-2(B):VLgeneproducts2.3.3ScFv扩增的电泳结果VH、VL大量扩增用胶回收试剂盒回收纯化，采用SOE-PCR法合成ScFv全长基因，片段大小约为780bp，电泳鉴定后，大量扩增并回收，回收产物即为小鼠单链抗体基因。结果如图2.4所示。图2.4ScFv扩增电泳结果Maker：DL2000DNAMarker；1-4:ScFv基因产物（A）Maker12（B）Maker12－312bp100bp100bp－750bp500bp2000bp2000bp5000bp1000bp250bp3000bp1000bp1500bp750bp500bp250bp－432bp－－－－－－－－－－－－－Figure2.4ElectrophoresisassaysofScFvamplifiedMaker:DL2000DNAMarker;1-4:ScFvgeneproducts
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪圆环病毒2型Cap蛋白原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化[J]. 刘玉伟,辛长勋,孙盼盼,王硕,高梅,时建立,彭喆,吴晓燕,王永明,李俊. 黑龙江畜牧兽医. 2019(24)
[2]天然鼠源噬菌体抗体库的构建及抗鸡堆型艾美耳球虫裂殖子单链抗体的筛选（英文）[J]. 康茜,任志军,唐欣浩,王雪伟,陈颖彬,刘立元,秦建华,赵月兰. 中国兽医学报. 2018(11)
[3]高通量筛选大容量抗体库的方法学研究进展[J]. 赵雪玉,吴蓉. 西北国防医学杂志. 2018(01)
[4]肉品生产中禁用药物西马特罗研究进展[J]. 熊琳,萍阎,高雅琴,李维红,杨晓玲. 食品安全质量检测学报. 2017(01)
[5]西马特罗单克隆抗体的制备及免疫学特性鉴定[J]. 李君华,吴萌,程华,李亚璞,闫静辉,李春生. 畜牧与兽医. 2016(03)
[6]西马特罗免疫抗原合成方法的比较[J]. 李春生,李君华,武孝利,李素红,闫静辉,吴萌. 畜牧与兽医. 2014(08)
[7]动物性食品中β-兴奋剂残留概述[J]. 翟福丽,赖克强,张衍亮,黄轶群. 食品科学. 2011(05)
[8]我国动物疫病防控的问题与思考[J]. 张改平. 中国家禽. 2011(01)
[9]噬菌体抗体库中筛选抗GST单链抗体及其活性鉴定[J]. 唐喆伟,韩红辉,杜冰,王群,钱旻,李恺. 现代免疫学. 2010(05)
[10]抗EGFRvⅢ噬菌体抗体库的构建和筛选[J]. 周敏,石必枝,顾健人,李宗海. 中国生物工程杂志. 2010(04)
硕士论文
[1]广谱有机磷农药单克隆抗体、单链抗体的制备及免疫检测技术研究[D]. 张晓帅.兰州大学 2018
[2]噬菌体天然抗体库淘选及筛选方法的优化[D]. 蒋红欣.上海交通大学 2018
[3]猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白噬菌体单链抗体库的构建与筛选[D]. 张秋丽.郑州大学 2017
[4]GPC3单链抗体的筛选、多克隆抗体制备以及在肝细胞癌检测中的应用[D]. 汪胜豪.浙江大学 2018
[5]抗猪流行性腹泻病毒猪源化嵌合单链抗体scFv-Fc的构建、表达及活性鉴定[D]. 宋晓峰.河南农业大学 2016
[6]重叠延伸PCR（SOE PCR）技术在洛伐他汀九酮合成酶基因克隆中的应用[D]. 黄卓.海南大学 2010
本文编号：3432839
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3432839.html
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