大鼠RNAi-A2aR慢病毒载体的构建及鉴定

发布时间：2021-10-12 22:05

　　目的构建大鼠RNAi-腺苷A2a受体（A2aR）慢病毒载体并进行鉴定。方法首先构建3对短发夹RNA（shRNA）-A2aR序列（shRNA-A2aR 1、shRNA-A2aR 2、shRNA-A2aR 3）,在shRNA慢病毒载体中分别插入3对双链shRNA oligo,shRNA慢病毒重组质粒构建成功后,将重组质粒、包装载体、穿梭载体共转染293T细胞,从而获得病毒液。实验Ⅰ采用随机数字表法将大鼠原代心肌细胞分为3组（n=6）:空载组（V组）、shRNA-A2aR 1组和shRNA-A2aR 3组,各组分别转染MOI为10的相应病毒液,转染48 h时,Western blot法检测A2aR表达水平,确定干扰效率,以筛选最佳慢病毒载体。实验Ⅱ采用随机数字表法将大鼠原代心肌细胞分为5组（n=36）:空载组（V组）、MOI5组、MOI10组、MOI15组和MOI20组,各组分别转染相应MOI的病毒液（最佳慢病毒载体）,于转染24、48和72 h时,采用CCK-8法测定细胞存活率,荧光显微镜下观察细胞活力和细胞死亡情况,Western blot法检测A2aR表达水平,确定干扰效率。结果实验Ⅰ... 

【文章来源】：中华麻醉学杂志. 2020,40(07)北大核心CSCD

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本文编号：3433386