基于URA3基因快速构建表达载体及其在里氏木霉的应用

发布时间：2021-10-19 19:04

　　【背景】表达载体是基因工程必不可少的工具,对于真菌如里氏木霉（Trichoderma reesei）等,由于缺乏商品化的表达载体,使其基因工程蛋白表达既复杂又费时而难以开展。【目的】建立一种利用URA3序列快速构建表达载体的方法,解决真菌研究中难以简单、高效和快速构建表达载体的难题。【方法】基于URA3基因的序列,利用其启动子上游5′端序列和终止子下游3′端序列构建同源重组臂,通过同源重组臂定向同源重组到宿主基因组上,利用强启动子和终止子替换URA3基因,从而实现外源基因的表达。根据此方法构建pTRUC表达载体,将红色荧光蛋白基因mCherry克隆到该表达载体上,转化里氏木霉中并验证m Cherry的表达。【结果】阳性转化子在荧光显微镜下观察到强的红色荧光信号,在基因组PCR中检测到mCherry,Westernblotting结果表明红色荧光蛋白m Cherry能在里氏木霉中表达,以上结果说明该载体构建成功,使外源基因mCherry在里氏木霉中正确表达。【结论】基于URA3基因的快速构建表达载体及其构建方法切实可行,将成为推动真核表达系统表达异源蛋白的有力工具。 

【文章来源】：微生物学通报. 2020,47(02)北大核心CSCD

【文章页数】：10 页

【部分图文】：

RUT-C30基因组DNA提取结果

将重组载体pTRUC-mCherry转化至RUT-C30中进行表达鉴定，对载体p TRUC的表达功能进行鉴定，挑取菌丝体在激光共聚焦显微镜使用587 nm激发光条件下，可观察到发出红色荧光的菌丝体，而亲本菌株在相同条件下没有观察到红色荧光(图5)，表明载体p TRUC对插入的外源基因可进行有效的转录，并在RUT-C30中表达出红色荧光蛋白质，说明p TRUC表达载体能实现外源蛋白在RUT-C30中的表达。图4 p TRUC-mCherry质粒双酶切结果

图3 p TRUC载体及5个DNA片段扩增结果由于里氏木霉是多细胞的丝状体，其菌丝体任何一点都能发生分枝，在菌落发育的后期，菌丝之间相互接触，在菌丝接触点相近的壁局部降解而发生菌丝的结网现象，使菌落形成一个完整的网状结构，其意义在于将菌丝用放射状二维平面扩散到三维网状，使得营养物质等可以运送到菌落的任一地方[24]。重组mCherry里氏木霉菌株的菌丝体同样也有菌丝融合现象，当菌丝发生结网融合时，其表达的m Cherry红色荧光蛋白也会互相分享，高表达m Cherry红色荧光的转化子会与低表达的转化子或者是非转化子之间分享细胞质中的m Cherry蛋白，从而表现出某一段菌丝表达量很高，其他菌丝表达量较低的情况，这也是丝状真菌表达较难筛选纯高表达菌株的原因之一。

【参考文献】：
期刊论文
[1]几种新型植物基因表达载体的构建方法[J]. 张阳璞,杨淑慎.  生物工程学报. 2015(03)
[2]水稻野生种质优异基因分子标记定位和利用的研究进展[J]. 谢建坤,孔祥礼,包劲松,万勇.  遗传. 2004(01)



本文编号：3445442