番茄中SlHB8植物超表达载体构建及遗传转化
发布时间：2021-10-25 23:59
SlHB8属于HD-ZipⅢ转录因子家族,通过分析番茄已有的RNA-seq数据,发现SlHB8可能对单性结实的形成具有一定的调控作用。为了研究SlHB8对番茄单性结实形成的生物学功能,本研究利用Gateway克隆技术,通过SlHB8的同义突变SlHB8Ris的miR165/166识别位点来构建该基因的植物超表达载体。通过农杆菌介导法对番茄进行遗传转化,PCR检测鉴定阳性转化植株,对T0代阳性植株进行qRT-PCR表达量分析,结果表明阳性转化植株中SlHB8基因的表达量均有不同程度的提高,从而为阐明SlHB8基因的生物学功能提供了一定的理论参考。
【文章来源】：分子植物育种. 2020,18(05)北大核心CSCD
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
SlH B8Ris基因的克隆及过表达载体的构建
通过分析单性结实突变体pat的RNA-seq数据，发现在pat子房发育过程中HD-ZipⅢ家族成员中只有SlHB8基因的表达量发生了显著变化，并且SlHB8基因的表达依赖于授粉受精(pollination-dependent gene)，与野生型相比SlHB8在pat盛开花子房中的表达量升高了2～3倍(图1A)。另外一组RNA-Seq数据表明SlHB8可以被生长素、赤霉素以及授粉受精诱导表达，在生长素、赤霉素诱导坐果的单性结实番茄子房中以及人工授粉诱导坐果的番茄子房中SlHB8的表达量升高了2～3倍，而没有成功坐果的番茄子房中SlHB8的表达量是未处理子房中SlHB8表达量的0.622倍(图1B)，推测该基因对番茄坐果具有重要的调节作用。1.2 SlHB8基因的克隆及植物超表达载体的构建
HD-ZipⅢ家族成员被miR165/166转录后调控(Hu et al.,2014)。因此，通过SlHB8的同义突变SlH-BRis的miR165/166识别位点来构建该基因的植物超表达载体(图2)。从番茄的数据库(https://solgenomics.net/)中获取番茄SlHB8的全长序列，根据miR165/166识别位点设计前后引物，利用重叠PCR的原理获得突变的SlHB8全长序列，将获得产物经过电泳验证(图3A)，并命名为SlHB8Ris。取适量产物通过BP酶重组反应，重组至入门载体上pDonor 207，经庆大霉素筛选后，挑取单菌落提取质粒进行检测(图3B)，电泳结果显示产物与目的片段大小相一致。挑选克隆送擎科生物公司测序。结果验证序列与SlHB8Ris序列一致，说明基因SlHB8Ris已成功重组至入门载体上。入门载体与植物超表达载体pMDC32在LR重组酶的作用下进行重组反应，将反应产物转化大肠杆菌感受态，经卡那霉素筛选后挑取单克隆提取质粒并进行检测(图3C)，结果表明，目的片段与预期的相一致，目的片段已经成功重组到植物超表达载体pMDC32中，即SlHB8植物过表达载体(pMDC32-Sl HB8Ris)已构建成功。1.3 SlHB8Ris过表达番茄植株的获得和阳性鉴定
【参考文献】：
期刊论文
[1]番茄营养成分以及国内外加工现状[J]. 赵美佳,邹通,汤泽君,李存香. 食品研究与开发. 2016(10)
[2]单性结实樱桃番茄新品种浙樱粉1号的选育[J]. 阮美颖,周国治,叶青静,李志邈,王荣青,姚祝平,万红建,杨悦俭. 中国蔬菜. 2016(02)
[3]番茄单性结实研究进展[J]. 张少丽,邵景成,胡志峰,魏兵强. 园艺学报. 2016(01)
[4]单性结实的分子研究进展[J]. 涂冬萍,马小军,莫长明,潘丽梅,冯世鑫,黄杰. 中草药. 2014(20)
[5]植物果实发育调控的分子机理研究进展[J]. 蒋励,张小兰. 中国蔬菜. 2013(06)
[6]用单性结实基因defH9-iaaM转化糖橙的研究[J]. 罗赛男,邓子牛,钟晓红,张家银,袁飞荣,杨莉. 湖南农业大学学报(自然科学版). 2008(02)
[7]番茄ps-2雄性不育品系的初步观察[J]. 李君明,Bistra Atanassova,徐和金,周永健,杨宝军. 园艺学报. 2002(04)
本文编号：3458421
【文章来源】：分子植物育种. 2020,18(05)北大核心CSCD
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
SlH B8Ris基因的克隆及过表达载体的构建
通过分析单性结实突变体pat的RNA-seq数据，发现在pat子房发育过程中HD-ZipⅢ家族成员中只有SlHB8基因的表达量发生了显著变化，并且SlHB8基因的表达依赖于授粉受精(pollination-dependent gene)，与野生型相比SlHB8在pat盛开花子房中的表达量升高了2～3倍(图1A)。另外一组RNA-Seq数据表明SlHB8可以被生长素、赤霉素以及授粉受精诱导表达，在生长素、赤霉素诱导坐果的单性结实番茄子房中以及人工授粉诱导坐果的番茄子房中SlHB8的表达量升高了2～3倍，而没有成功坐果的番茄子房中SlHB8的表达量是未处理子房中SlHB8表达量的0.622倍(图1B)，推测该基因对番茄坐果具有重要的调节作用。1.2 SlHB8基因的克隆及植物超表达载体的构建
HD-ZipⅢ家族成员被miR165/166转录后调控(Hu et al.,2014)。因此，通过SlHB8的同义突变SlH-BRis的miR165/166识别位点来构建该基因的植物超表达载体(图2)。从番茄的数据库(https://solgenomics.net/)中获取番茄SlHB8的全长序列，根据miR165/166识别位点设计前后引物，利用重叠PCR的原理获得突变的SlHB8全长序列，将获得产物经过电泳验证(图3A)，并命名为SlHB8Ris。取适量产物通过BP酶重组反应，重组至入门载体上pDonor 207，经庆大霉素筛选后，挑取单菌落提取质粒进行检测(图3B)，电泳结果显示产物与目的片段大小相一致。挑选克隆送擎科生物公司测序。结果验证序列与SlHB8Ris序列一致，说明基因SlHB8Ris已成功重组至入门载体上。入门载体与植物超表达载体pMDC32在LR重组酶的作用下进行重组反应，将反应产物转化大肠杆菌感受态，经卡那霉素筛选后挑取单克隆提取质粒并进行检测(图3C)，结果表明，目的片段与预期的相一致，目的片段已经成功重组到植物超表达载体pMDC32中，即SlHB8植物过表达载体(pMDC32-Sl HB8Ris)已构建成功。1.3 SlHB8Ris过表达番茄植株的获得和阳性鉴定
【参考文献】：
期刊论文
[1]番茄营养成分以及国内外加工现状[J]. 赵美佳,邹通,汤泽君,李存香. 食品研究与开发. 2016(10)
[2]单性结实樱桃番茄新品种浙樱粉1号的选育[J]. 阮美颖,周国治,叶青静,李志邈,王荣青,姚祝平,万红建,杨悦俭. 中国蔬菜. 2016(02)
[3]番茄单性结实研究进展[J]. 张少丽,邵景成,胡志峰,魏兵强. 园艺学报. 2016(01)
[4]单性结实的分子研究进展[J]. 涂冬萍,马小军,莫长明,潘丽梅,冯世鑫,黄杰. 中草药. 2014(20)
[5]植物果实发育调控的分子机理研究进展[J]. 蒋励,张小兰. 中国蔬菜. 2013(06)
[6]用单性结实基因defH9-iaaM转化糖橙的研究[J]. 罗赛男,邓子牛,钟晓红,张家银,袁飞荣,杨莉. 湖南农业大学学报(自然科学版). 2008(02)
[7]番茄ps-2雄性不育品系的初步观察[J]. 李君明,Bistra Atanassova,徐和金,周永健,杨宝军. 园艺学报. 2002(04)
本文编号：3458421
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