miR-29对GnRH基因启动子区特定位点甲基化的影响研究

发布时间：2021-11-02 00:13

　　检测GT1-7细胞中miR-29对GnRH启动子区域甲基化的影响,探究GnRH特定位点的甲基化与其表达量的相关性。采用重亚硫酸盐测序（BSP）结合二代测序技术（NGS）的方法检测GT1-7及miR-29敲除的GT1-7（miR-29KO-GT1-7）细胞中GnRH启动子区7个CpG位点的甲基化程度。根据测序结果,利用CRISPR-dCas9技术在差异显著的CpG6位点特异性富集Dnmt3a、Tet1,并通过二代测序检测该位点甲基化变化,同时利用实时荧光定量PCR技术检测GnRH的表达量,验证二者之间的相关性。结果显示:在miR-29KO-GT1-7细胞中,与对照组相比,在CpG6位点富集Dnmt3a后其甲基化水平上升17%,GnRH的表达水平下降40%（P<0.01）;在GT1-7细胞中,CpG6位点富集Tet1,可使其甲基化水平下降20%,GnRH的表达水平上升50%（P<0.05）。结果表明miR-29可通过影响GnRH启动子DNA甲基化水平尤其是特定CpG位点的甲基化程度调控GnRH的表达,为进一步研究解析性发育的调控提供了新的表观遗传机制。 

【文章来源】：生物学杂志. 2020,37(06)北大核心CSCD

【文章页数】：5 页

【部分图文】：

CRISPR-dCas9-Dnmt3a(a)/Tet1(b)过表达载体的构建

针对GnRH启动子区的CpG6位点和CpG2位点分别设计sgRNA(sgRNA-CpG6、sgRNA-CpG2),针对Sp1基因的sgRNA-Sp1用作实验对照,将sgRNA构建到42230-EGFP载体上获得重组载体,sgRNA设计及引物序列详情见图3和表3。载体送上海生工生物有限公司测序鉴定后使用。1.2.5 CRISPR-dCas9-Dnmt3a/Tet1载体和42230-sgRNA-EGFP载体的共转染

利用Methyl Primer软件和Oligo 7软件在线设计BSP引物,分成5个区段(M1、M2、M3、M4、M5)PCR扩增GnRH基因启动子-1005～+1的7个CpG位点。反应条件:95 ℃预变性 15 min;98 ℃ 变性15 s,55 ℃ 退火1 min,72 ℃ 延伸30 s,共40个循环;72 ℃ 再延伸10 min。扩增区段详见图1,BSP引物序列见表1。表1 BSP引物Table 1 Primer sequences of BSP 引物Primer 引物序列(5′-3′)Primer Sequence GnRH-M1-F ACGACGTGTCGAGTTCAGGTATTAGTTTGGTTTATATAGTTTTAGG GnRH-M1-R CAGTGAGTCGCCACAGGTCAAATACACTACCGCTATCTTCAAAC GnRH-M2-F ACGACGTGTCGAGTTCAGGTATTATTTTTAGTGGGATTTGATG GnRH-M2-R CAGTGAGTCGCCACAGGTCATACCACCACACCTAACTTAATT GnRH-M3-F ACGACGTGTCGAGTTCAGGTATAATTAAGTTAGGTGTGGTGGT GnRH-M3-R CAGTGAGTCGCCACAGGTCAAACCCACTTTATAAACCAATCT GnRH-M4-F ACGACGTGTCGAGTTCAGGTTGGGTTTTAGGATAGTTAGGGT GnRH-M4-R CAGTGAGTCGCCACAGGTCATAAACAAACACACACACACAAA GnRH-M5-F ACGACGTGTCGAGTTCAGGTTTATTTGTTTGTGTGAATGTGTT GnRH-M5-R CAGTGAGTCGCCACAGGTCATAAATTCTATCCCAAAATCCC 注:粗斜体为通用序列(由无锡翼和应用生物技术有限公司提供)。

【参考文献】：
期刊论文
[1]DNA甲基化在基因表达调控中的意义及研究进展[J]. 钟焱,徐慧,彭凤兰.  中国医药导报. 2019(14)



本文编号：3470957