蜂毒肽在大肠杆菌中的高效融合表达与纯化

发布时间：2021-11-10 13:46

　　生物法制备蜂毒肽是实现大量制备蜂毒肽的关键技术。为实现蜂毒肽的高效表达,通过化学法合成含信号肽、前导肽和成熟肽的蜂毒肽基因promet和蜂毒肽成熟肽基因met,与麦芽糖结合蛋白基因mbp连接,克隆到载体pET15-b,构建重组质粒pET-MBP-MET和pET-MBPproMET。重组质粒转化大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）,以0.1 mmol/L IPTG进行诱导,30℃下过夜诱导,融合蛋白MBP-MET、MBP-proMET在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达。两种目标蛋白质经Ni柱和Dextrin Sepharose HP两步亲和纯化,得到了纯度达90%以上的融合蛋白MBP-MET、MBP-proMET,培养1 L大肠杆菌菌液能制备约20 mg纯蛋白质。通过牛津杯抑菌实验发现,MBP-MET、MBP-proMET能明显抑制细菌生长,产生明显的抑菌圈,MBP-MET和MBP-proMET最低抑菌浓度（MIC）分别为100μg/mL和140μg/mL。本研究首次实现了蜂毒肽的高效表达,并进行了抑菌功能验证,为生物法制备蜂毒肽提供了高效、安全的合成途径。 

【文章来源】：食品与生物技术学报. 2020,39(08)北大核心CSCD

【文章页数】：8 页

【部分图文】：

标签融合的p ET-MBP-MET、p ET-MBP-pro MET质粒构建示意图

蜂毒肽met、前蜂毒肽promet与麦芽糖结合蛋白mbp基因经PCR扩增后分别获得126、252、1 152 bp的特异性片段，见图2。重叠延伸后得到MBP-MET和MBP-pro MET片段。将PCR产物连接至克隆载体p MD19-T，测序结果表明MBP-MET基因片段正确插入p MD19-T载体。2.2 重组表达载体p ET-MBP-MET、p ET-MBP-pro MET构建

将表达质粒p ET-MBP-MET转入E.coli BL21，挑取单菌落培养，在0.1 mmol/L IPTG、30℃条件下诱导表达，收集细胞，每100 m L培养基能收集0.6 g湿菌。重悬并超声破碎后离心收集上清液，进行SDS-PAGE验证。结果如图3所示，上清液可见相对分子质量46 200（见图3(a））和50 800（见图3 (b））的条带，分别与融合蛋白质MBP-MET和MBP-pro MET理论大小一致，且上清液中目标条带浓度高于沉淀。经凝胶电泳成像仪分析，上清液的目标条带占全细胞总量的15%，说明融合蛋白质MBP-MET在重组大肠杆菌中主要以可溶性蛋白质的形式表达。2.4 融合蛋白质MBP-MET和MBP-pro MET的纯化

【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3487371